本網訊 近日，中國農業大學資源與環境學院生態與功能農業課題組郭巖彬副教授在生態環境科學和工程領域Top期刊《Journal of Hazardous Materials》上發表題為“Highly stable selenium nanoparticles: Assembly and stabilization via flagellin FliC and porin OmpF in Rahnella aquatilis HX2”的文章。
硒是人和動物必需的微量礦質元素，但其有益到有害的濃度范圍較窄，成為制約硒營養強化等應用的關鍵問題。納米粒徑的單質硒（納米硒）因具有活性強、毒性低等特點使其成為解決硒應用濃度范圍窄的最佳硒形態，同時納米硒在生物體內表現出抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多重生物活性而備受國內外關注。納米硒可以通過化學還原方法獲得（化學納米硒），也可以通過微生物（細菌等）生物合成途徑獲得（生物納米硒）。與化學納米硒相比，細菌合成的生物納米硒具有穩定性高、活性強、生物轉化效率高、環境風險小等優勢，使其成為國內外研究的熱點。但國內外關于生物納米硒在細菌體內如何組裝以及其結構穩定機制還缺乏系統性研究。該研究揭示了細菌生物合成納米硒在體內的組裝控制及維持其結構穩定性的機制。
課題組利用生物納米硒高效合成菌株Rahnella aquatilis HX2發酵合成生物納米硒，并將其進行了分離和純化，獲得的生物納米硒與化學納米硒相比，在酸、堿、陽離子、氧化劑和高低溫等條件下具有顯著性的穩定性。為解析細菌合成的生物納米硒高穩定性機制，從純化的生物納米硒上剝離獲得兩種蛋白，分別為鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF。在R. aquatilis HX2菌體內通過基因缺失突變，獲得fliC 和ompF單基因突變體，或fliC 和ompF雙基因突變體，無論單基因突變還是共同突變，都不影響生物納米硒在細菌中的合成量，但影響生物納米硒在細菌中的組裝，在突變體中生物納米硒球形組裝能力喪失，生物納米硒由球形變成了不規則形。在突變體中遺傳互補fliC 和ompF基因后，生物納米硒的組裝得到恢復，恢復成球形納米硒，從而揭示了生物納米硒在細菌體內維持球形結構的穩定性機理。
為驗證鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF是否具有體外組裝功能，將HX2菌株的鞭毛蛋白FliC-HX2 和孔蛋白OmpF-HX2和大腸桿菌K12菌株中的鞭毛蛋白FliC-K12 和孔蛋白OmpF-K12分別進行了外源表達和純化。利用外源表達蛋白在體外進行納米硒組裝，結果表明FliC-HX2、OmpF-HX2、FliC-K12 和OmpF-K12都可以在體外實現納米硒的組裝，其中來源于HX2菌株的FliC-HX2和OmpF-HX2蛋白組裝的納米硒比大腸桿菌的FliC-K12 和OmpF-K12組裝的納米硒粒徑小。從體外組裝的納米硒上剝離蛋白，并利用抗體對剝離的蛋白進行Western blot檢測，驗證了納米硒體外組裝由這四個蛋白分別控制。研究結果說明鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF在無論是細菌體內還是在體外都可以控制納米硒的組裝。
為進一步分析驗證鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF在生物納米硒結構穩定中的作用，利用外源表達的FliC-HX2和OmpF-HX2對化學納米硒進行表面修飾，在強酸、強堿、高離子濃度條件下分析修飾后的化學納米硒的穩定性，并以納米材料常用的結構穩定劑SDS、PEG、BSA、PVP，以及大腸桿菌的FliC-K12 和OmpF-K12作為對照，SDS和PEG在強酸堿等測試條件下無法穩定化學納米硒的結構，BSA、PVP、FliC-K12 和OmpF-K12在不同程度上均可以提高化學納米硒的穩定性，水生拉恩氏菌FilC-HX2和OmpF-HX2的穩定效能是PVP、BSA以及大腸桿菌FilC和OmpF的10-100倍。研究結果表明，水生拉恩氏菌HX2的鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF對維持生物納米硒的結構穩定具有極其重要的作用，并能夠在體外顯著提高化學納米硒的結構穩定性，該研究同時也發現水生拉恩氏菌HX2的鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF對維持納米硒的結構穩定能力具有特異性。該研究為納米硒在農業（種植、養殖等）以及生物醫藥等領域的應用提供了理論與技術支持。
據悉，近年來課題組共篩選獲得高效合成生物納米硒的細菌菌株近1000株，并完成了生物納米硒工廠化發酵工藝和分離純化工藝，建立了生物納米硒規模化生產技術。同時完成了納米硒在小麥、水稻、食用菌等作物的吸收轉化機理以及近30多種作物的富硒生產技術，相關研究成果先后在LWT - Food Science and Technology，Frontiers in Plant Science，Journal of Nanobiotechnology等期刊發表。相關技術成果在黑龍江、江西、湖南、重慶、河北、山西等十多個省市的小麥、水稻、大豆、小米等近20種作物示范推廣10多萬畝，取得了顯著經濟和社會效益。本研究內容已申請國家發明專利“提高納米材料穩定性的方法（2021101035703和2021101052624）”，課題組已獲授權生物納米硒國家發明專利6項，化學納米硒國家發明專利1項，其中“利用地衣芽孢桿菌生物合成納米硒的方法及其應用（ZL201610946282.3）”已經完成成果轉化，并被北京市知識產權局評選為“2018年度專利商用化優秀項目”。
博士生李奎為論文第一作者，郭巖彬副教授為論文的通訊作者。論文得到國家自然科學基金（項目編號：31470531）和國家公益性行業（農業）科研專項“優質高效富硒農產品關鍵技術研究與示范”（項目編號：201303106）項目資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.125545
日期：2021-03-04
硒是人和動物必需的微量礦質元素，但其有益到有害的濃度范圍較窄，成為制約硒營養強化等應用的關鍵問題。納米粒徑的單質硒（納米硒）因具有活性強、毒性低等特點使其成為解決硒應用濃度范圍窄的最佳硒形態，同時納米硒在生物體內表現出抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多重生物活性而備受國內外關注。納米硒可以通過化學還原方法獲得（化學納米硒），也可以通過微生物（細菌等）生物合成途徑獲得（生物納米硒）。與化學納米硒相比，細菌合成的生物納米硒具有穩定性高、活性強、生物轉化效率高、環境風險小等優勢，使其成為國內外研究的熱點。但國內外關于生物納米硒在細菌體內如何組裝以及其結構穩定機制還缺乏系統性研究。該研究揭示了細菌生物合成納米硒在體內的組裝控制及維持其結構穩定性的機制。
課題組利用生物納米硒高效合成菌株Rahnella aquatilis HX2發酵合成生物納米硒，并將其進行了分離和純化，獲得的生物納米硒與化學納米硒相比，在酸、堿、陽離子、氧化劑和高低溫等條件下具有顯著性的穩定性。為解析細菌合成的生物納米硒高穩定性機制，從純化的生物納米硒上剝離獲得兩種蛋白，分別為鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF。在R. aquatilis HX2菌體內通過基因缺失突變，獲得fliC 和ompF單基因突變體，或fliC 和ompF雙基因突變體，無論單基因突變還是共同突變，都不影響生物納米硒在細菌中的合成量，但影響生物納米硒在細菌中的組裝，在突變體中生物納米硒球形組裝能力喪失，生物納米硒由球形變成了不規則形。在突變體中遺傳互補fliC 和ompF基因后，生物納米硒的組裝得到恢復，恢復成球形納米硒，從而揭示了生物納米硒在細菌體內維持球形結構的穩定性機理。
為驗證鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF是否具有體外組裝功能，將HX2菌株的鞭毛蛋白FliC-HX2 和孔蛋白OmpF-HX2和大腸桿菌K12菌株中的鞭毛蛋白FliC-K12 和孔蛋白OmpF-K12分別進行了外源表達和純化。利用外源表達蛋白在體外進行納米硒組裝，結果表明FliC-HX2、OmpF-HX2、FliC-K12 和OmpF-K12都可以在體外實現納米硒的組裝，其中來源于HX2菌株的FliC-HX2和OmpF-HX2蛋白組裝的納米硒比大腸桿菌的FliC-K12 和OmpF-K12組裝的納米硒粒徑小。從體外組裝的納米硒上剝離蛋白，并利用抗體對剝離的蛋白進行Western blot檢測，驗證了納米硒體外組裝由這四個蛋白分別控制。研究結果說明鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF在無論是細菌體內還是在體外都可以控制納米硒的組裝。
為進一步分析驗證鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF在生物納米硒結構穩定中的作用，利用外源表達的FliC-HX2和OmpF-HX2對化學納米硒進行表面修飾，在強酸、強堿、高離子濃度條件下分析修飾后的化學納米硒的穩定性，并以納米材料常用的結構穩定劑SDS、PEG、BSA、PVP，以及大腸桿菌的FliC-K12 和OmpF-K12作為對照，SDS和PEG在強酸堿等測試條件下無法穩定化學納米硒的結構，BSA、PVP、FliC-K12 和OmpF-K12在不同程度上均可以提高化學納米硒的穩定性，水生拉恩氏菌FilC-HX2和OmpF-HX2的穩定效能是PVP、BSA以及大腸桿菌FilC和OmpF的10-100倍。研究結果表明，水生拉恩氏菌HX2的鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF對維持生物納米硒的結構穩定具有極其重要的作用，并能夠在體外顯著提高化學納米硒的結構穩定性，該研究同時也發現水生拉恩氏菌HX2的鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF對維持納米硒的結構穩定能力具有特異性。該研究為納米硒在農業（種植、養殖等）以及生物醫藥等領域的應用提供了理論與技術支持。
據悉，近年來課題組共篩選獲得高效合成生物納米硒的細菌菌株近1000株，并完成了生物納米硒工廠化發酵工藝和分離純化工藝，建立了生物納米硒規模化生產技術。同時完成了納米硒在小麥、水稻、食用菌等作物的吸收轉化機理以及近30多種作物的富硒生產技術，相關研究成果先后在LWT - Food Science and Technology，Frontiers in Plant Science，Journal of Nanobiotechnology等期刊發表。相關技術成果在黑龍江、江西、湖南、重慶、河北、山西等十多個省市的小麥、水稻、大豆、小米等近20種作物示范推廣10多萬畝，取得了顯著經濟和社會效益。本研究內容已申請國家發明專利“提高納米材料穩定性的方法（2021101035703和2021101052624）”，課題組已獲授權生物納米硒國家發明專利6項，化學納米硒國家發明專利1項，其中“利用地衣芽孢桿菌生物合成納米硒的方法及其應用（ZL201610946282.3）”已經完成成果轉化，并被北京市知識產權局評選為“2018年度專利商用化優秀項目”。
博士生李奎為論文第一作者，郭巖彬副教授為論文的通訊作者。論文得到國家自然科學基金（項目編號：31470531）和國家公益性行業（農業）科研專項“優質高效富硒農產品關鍵技術研究與示范”（項目編號：201303106）項目資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.125545
日期：2021-03-04
