| 一、 原理 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產和雞肉等組織樣本中的呋喃唑酮，在微孔條上預包被上偶聯抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的原理來進行的，樣本中的呋喃唑酮和微孔條上預包被偶聯抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物的衍生物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的呋喃唑酮含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出呋喃唑酮代謝物含量。 二、 試劑盒技術指標： 試劑盒靈敏度： 0.1 ppb 樣本檢測下限： 組織、蜂蜜 0.2 ppb 魚/蝦等水產品組織因存在一定的干擾，檢測下限為0.3 ppb 回收率： 魚/蝦水產組織 90%±15% 蜂蜜/雞肉/肝臟樣本 80%±15% 交叉反應率： 呋喃唑酮代謝物 呋喃它酮代謝物 ﹤0.1% 呋喃妥因代謝物 ﹤0.1% 呋喃西林代謝物 ﹤0.1% 三、試劑盒組成 1．微量測試孔： 96T/8孔 2．標準品液： 0 ppb 0.1 ppb 0.3 ppb 0.9 ppb 2.7 ppb 8.1 ppb （1mL/瓶） 3．酶標記物 12 mL 4．抗體工作液 7 mL 5．底物緩沖液 7 mL 6．底物液 7 mL 7．終止液 7 mL 8．20倍濃縮洗滌液 50 mL 加蒸餾水稀釋到1000 mL。 9．復溶液 50 mL 10．15.1 mg衍生化試劑 四、 所用儀器、試劑 具備的儀器： 微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01 g） 微量移液器： 單道20 µL-200 µL，100 µL-1000 µL、多道250 µL 試 劑： 甲醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、濃HCl、磷酸氫二鉀、鄰硝基苯甲醛、亞硝基鐵（K2Fe（CN）5·NO·3H2O）ZnSO4·7H2O 五、樣本前處理步驟 樣本處理前須知 處理任何樣本時，都必須注意： （a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。 （b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。 樣本前處理需配制： 1．衍生化試劑 稱15.1 mg鄰硝基苯甲醛加甲醇10 mL溶解(濃度10 mM) 2．C液：（供奶樣用）稱12.5 g亞硝基鐵用去離子水定溶至100 mL。 D液：（供奶樣用）稱29.8 g 硫酸鋅用去離子水溶解定溶至100 mL。 3．0.1 M K2HPO4 稱22.8 g K2HPO4·3H2O加去離子水溶解定溶至1L 4．1 M HCl取8.6 mL濃HCl加水定溶至100 mL。 5．1 M NaOH稱取4 g NaOH加水定溶至100 mL。 樣本的處理 (a) 肉樣或魚蝦 用均質器均質樣本,接（d）的描述方法 (b) 奶樣 1. 取出5 mL的奶樣本到玻璃離心管中，分別加入C液和D液各250 µL。 2. 用振蕩器充分混合樣本,用恒溫離心機4000 r/min以上離心10 min(4-12 ℃)。若沒有恒溫離心機，則先將樣本降溫至大約2-8 ℃，然后離心。 3. 接(d)的描述方法 (c) 蜂蜜 1. 取1±0.05 g樣本到離心管中。 2. 加入4 mL的去離子水溶解,再加入0.5 mL 1 M HCl和100 µL衍生化試劑,充分振蕩。 3. 接(d)第2步描述方法 (d)接上面的方法 1． 取1±0.05 g的均質樣本(肉樣/魚蝦)、牛奶的離心上清液1.1 mL（相當1 mL奶樣），分別加入4 mL的去離子水，0.5 mL 1 M HCl和100 µL衍生化試劑，充分振蕩。 2．置于56 ℃環境中孵育（2 h）。 3．分別加入5 mL 0.1 M K2HPO4， 0.4 mL 1M NaOH和5 mL的乙酸乙酯，充分振蕩30 s； 4．在室溫下（20-25 ℃）4000 r/min以上離心10 min。 5．取出2.5 mL的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于50 ℃氮氣/空氣吹干。 6．用1 mL正己烷溶解干燥物，用1 mL已稀釋好的復溶液充分混合；在室溫下（20-25 ℃）4000 r/min以上離心10 min。 7．取50 µL下層相用于分析。 樣本稀釋倍數：2 六、操作步驟 1． 將試劑盒從冷藏環境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2． 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。 3． 加標準品/樣本50 µL /孔，然后加入抗體工作液50 µL /孔，再振蕩混勻，用封板膜蓋板，37 ℃反應30 min。 4． 洗板4-5次，每次浸泡30 s ，拍干。 5． 加入酶標記物100 µL /孔，用封板膜蓋板，37 ℃反應20 min。 6． 洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 7． 顯色：每孔加入底物緩沖液50 µL，再加底物液50 µL，輕輕振蕩混勻，37 ℃環境避光顯色10 min。 8． 測定：每孔加入終止液50 µL，輕輕振蕩勻，設定酶標儀于450 nm處（在20 min內讀完數據），測定吸光度值。 七、結果判定 以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃唑酮標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃唑酮實際濃度。 八、注意事項 1．反應溫度低于37 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25 ℃）會導致OD值偏低。 2．洗板拍干后應立即進行下一步操作。 3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會出現重復性不好的現象。 4．反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。 5．將不用的微孔板放進自封袋重新密封， 標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 6．不要使用過了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號試劑盒中的試劑。 7．顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之，0標準的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。 九、儲藏條件和保質期 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。 保質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒 | |
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