| 一、目的要求 |
| 1.掌握反相離子對色譜分離水溶性纖維素的方法。 2.了解反相離子對色譜分離水溶性纖維素的原理及方法特點(diǎn)。 |
| 二、基本原理 |
| 水溶性纖維素包括：VB1 (硫胺素)，VB2(核黃素)，VB5(煙酰胺，煙酸)，VB6(吡哆醛、吡哆醇)，VB11（葉酸），VB12(鈷 維生素)和VC等。在用反相離子對色譜法測定中，陽離子A+(樣品離子)和反離子B-(烷基磺酸根離子)先形成離于對，再在 流動相和固定相中分配， 保留時(shí)間為： tR=tM (1+ EA，B[B-]水相/β) 式中，β為相比，tM為死時(shí)間，EA，B為平衡常數(shù)。 可見樣品的保留時(shí)間受離子對試劑的濃度和可逆過程的總平衡常數(shù)的影響。因此，對混合水溶性纖維素分離的影響， 除反離子的濃度外，還有流動相的pH值，甲醇與水的配比，有機(jī)添加劑三乙胺(TEA)濃度和柱溫。TEA作為流動相的添加 劑，可減少堿性樣品色譜峰的拖尾。 |
| 三、儀器與試劑 |
| 1．儀器高效液相色譜儀；超聲波發(fā)生器。 2．試劑： 甲醇；十二烷基磺酸鈉；三乙胺；水溶性纖維素混合標(biāo)樣。 混合標(biāo)樣配制方法： 將VB1、煙酸、煙酰胺、吡哆醛、吡哆醇、VB12和VC溶于水配成含量均為30μg／m1的水溶液(溶液1)。將VB2和VB11滴入少 量發(fā)5％Na0H使之溶解，再用去離子水稀釋至各含100μg／m1的混合液(溶液2)。使用前，將溶液l和溶液2以1：1混合 ，配成含9種纖維素的混合標(biāo)樣。以相應(yīng)的方法制成各維生素的單個標(biāo)樣。 |
| 四、實(shí)驗(yàn)步驟 |
| 1．實(shí)驗(yàn)條件： 1) 色譜柱：YWG—G18，10μm，25cm×φ4.6mm； 2) 流動相：甲醇：水=40：60，十二烷基磺酸鈉1.5mmol/l，三乙胺0.3％，用磷酸調(diào)節(jié)PH至3.0； 3) 檢測器：UV—254nm； 4) 流動相流速：1.0mI／mln； 5) 校溫：30℃。 2．啟動儀器，用大約180m1流動相流經(jīng)色譜拄，待基線穩(wěn)定后，分別注入10μl的各單個維生素標(biāo)樣，記錄色譜圖 和出峰時(shí)間。 3．注入10μll混合試樣，記錄色譜圖和各峰的出峰時(shí)間。 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用90％甲醇一水溶液沖洗色譜拄1h左右。 |
| 五、數(shù)據(jù)處理 |
| 根據(jù)標(biāo)樣的保留時(shí)間找出混合試樣色譜圖中各峰對應(yīng)的樣品名稱。 |
| 六、問題討論 |
| １.試述反相離子對色譜的分離機(jī)理。 ２.反相離子對色譜同時(shí)分離混合水溶性纖維素有哪些影響因素？ |
| 七、渣意事項(xiàng) |
| 1.制備流動相用試劑均為分析純，水用二次蒸餾水，維生素為生物試劑。 2.用庚烷鹽作為離子對試劑效果更優(yōu)，但其價(jià)格較貴。 |
