125I標記單克隆抗體技術(shù)

 125I標記單克隆抗體技術(shù) 
同位素標記是一種重要的抗體標記技術(shù)，牨977年Yalow等在放射免疫測定法所作突出貢獻而獲得醫(yī)學(xué)和生理學(xué)諾貝爾獎。McAb標記同位素后除應(yīng)用于放射免疫測定外，還可用于競爭結(jié)合試驗、體內(nèi)腫瘤定位等。
 
　　一　原理
氯胺桾即對甲苯碘氯胺鈉，在水溶液中生成次氯酸，為一種溫和氧化劑，當加入到有蛋白質(zhì)和碘的弱堿水溶液中，可將I２氧化為I＋并結(jié)合到氨基酸上。如標記條件溫和，標記后的McAb仍具有良好的結(jié)合活性，通過放射性同位素強度的測定可反映相應(yīng)抗原的含量。
 
　　二　方法
　　　　　　在細胞凍存管內(nèi)加入純化的McAb100μg／100μl，
　　　　　　再加入10μl 0.05M磷酸緩沖液
　　　　　　再加入10μl含1mCi125I
　　　　　　　　　　↓
　　　　　　加入10μl氯胺-T5mg／ml溶于0.05M
　　　　　　磷酸鹽緩沖液，孵育時間不超過30秒
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　加入100μl偏重亞硫酸鈉1.2mg／ml溶于
　　　　　　0.05M磷酸緩沖液
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　加入200μl　KI溶液少許結(jié)晶KI溶于0.05M
　　　　　　磷酸緩沖液＋4％牛血清白蛋白
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　用PD10柱Sephadex G25除去游離125I
　　　　　　用4％BSA　PBS洗脫
　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　分部收集，0.5ml／管
　　每管取5μl進行γ計數(shù)，計算標記抗體的比活性和標記率
　　　　　　　　　　　結(jié)合于McAb１２５I放射性強度cpm
　　　　標記率％＝───────────────────
　　　　　　　　　　　　　　總放射性強度cpm
　　　　　　　　　　　　　　　　結(jié)合于某一管McAb上的放射性強度
　　　　比活性μCi／μgMcAb＝────────────────
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　某一管McAb總量
 
　　三　試劑器材
　　1.　純化后的McAb
　　2.　0.05M磷酸緩沖液，氯胺桾，偏重亞硫酸鈉，KI，BSA
　　3.　125I
　　4.　有通風(fēng)裝置的超凈臺，γ計數(shù)儀
5.　PD10柱Sephadex G25
 
　　四　注意事項
　　1.　嚴防同位素污染，工作人員必須穿著工作衣，戴口罩、帽子、手套。必須在嚴密的通風(fēng)櫥或通風(fēng)超凈臺中操作。操作前后對實驗室環(huán)境進行監(jiān)測。所用125I和標記物應(yīng)妥善保管。
　　2.　如標記細胞因子、激素等，應(yīng)選用更溫和的標記方法，使保持更好的生物學(xué)活性。