該成果以“A rapid method and mechanism to identify the active compounds in Malus micromalus Makino fruit with spectrum-effect relationship, components knock-out and molecular docking technology”為題發表于《Food and Chemical Toxicology》雜志上（即時IF:5.759，JCR TOP Q2區）
薔薇科蘋果屬植物西府海棠Malus micromalus Makino的果實化學成分種類豐富，主要包括黃酮類、有機酸類和揮發性成分等，藥理學研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤、預防心腦血管老化、淡化肝斑、抗炎、抗氧化和抗衰老等功效。
圖 1 西府海棠果實
本研究以西府海棠果實對酪氨酸酶的活性影響，結合HPLC指紋圖譜構建“譜-效模型”，通過譜-效關系篩選出活性物質，并采用成分敲出法和UPLC-MS/MS法對目標成分進行結構鑒定。
Fig.2 HPLC fingerprints of M. micromalus fruit and its reference fingerprint （R）
Fig.3 Standardization regression coefficient of PLSA model of characteristics common peak-tyrosinase inhibition activity.
Fig.4 The high resolution mass spectra of Peak 2 knocked-out component.
Fig.5 The high resolution mass spectra of Peak 8 knocked-out component.
Fig.6 The MS/MS fragmentation pathway of p-Coumaric acid （a）、
4-O-β-Glucopyranosyl-cis-coumaric acid （c）。
在此基礎上，采用酶促反應動力學探討敲出成分對酪氨酸酶催化反應的影響及動力學模型分析，并借助分子對接技術預測活性成分和酪氨酸酶的結合模式，闡明西府海棠果實中對酪氨酸酶起抑制/激活作用的活性成分及其作用機制。
Fig. 7 Lineweaver-Burk plots of tyrosinase after the addition of p-coumaric acid （a），phloridzin （b），quercetin-3-O-α-rhamnoside （c） and 4-O-β-glucopyranosyl-cis-coumaric acid （d）。
Fig. 8 Molecular docking interaction of tyrosinase with p-coumaric acid（a）， phloridzin（b），quercetin-3-O-α-rhamnoside（c） and 4-O-β-glucopyranosyl-cis-coumaric acid（d）
Note: （a, b, c, d） Plane projection diagram of the interaction between compound and tyrosinase.
本研究通過譜-效關系研究發現，在濃度0.5 g/mL時，西府海棠果實實對酪氨酸酶活性的抑制作用效果最好；PLS-DA分析顯示，西府海棠果實特征色譜中P2、P3、P5和P6對酪氨酸酶活性的抑制作用呈正相關（R＞0.1）；P8和P9對酪氨酸酶活性的抑制作用呈負相關（R＜-0.1）。通過UPLC-MS/MS法鑒定P2、P6、P8、P10、P11和12分別為對香豆酸、阿魏酸-酰基葡萄糖苷、香豆酸-4-O-葡萄糖苷、根皮素-2'-木糖葡萄糖苷、根皮苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。酪氨酸酶動力學實驗結果表明：對香豆酸（P2）、根皮苷（P11） （P11＞0.50 mmol/L）對酪氨酸酶具有競爭性抑制作用，其中根皮苷濃度小于0.25 mmol/L時，具有混合性抑制作用。香豆酸-4-O-葡萄糖苷（P8）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）分別在0~9 mmol/L、0.3-11 mmol/L的濃度范圍內主要表現為非競爭性激活類型，而槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）為混合型激活類型。酪氨酸酶分子對接結果表明：對香豆酸（P2）、香豆酸-4-O-葡萄糖苷（P8）、根皮苷（P11）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）位于酶的疏水口袋活性中心，與酪氨酸酶殘基以氫鍵結合，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同維持復合物的結構。
利用譜效關系，成分敲出及高分辨質譜鑒定技術快速鑒定復雜中藥體系活性成分，闡述中藥整體觀，挖掘活性成分/成分群領域，本團隊已形成了成熟的研究策略。研究成果先后發表在 Food and Chemical Toxicology （https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.110754）；
Food Science and Human Wellness （https://doi.org/10.1016/j.fshw.2021.02.019）；
Food and Chemical Toxicology （https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.110754）；
International Journal of Molecular Sciences （https://doi.org/10.3390/ijms19113439）；
Frontiers in pharmacology （https://doi.org/10.3389/fphar.2020.01342）等雜志。并以此技術創新集成，獲得2020年河南省科學技術進步二等獎。
日期：2021-03-09
薔薇科蘋果屬植物西府海棠Malus micromalus Makino的果實化學成分種類豐富，主要包括黃酮類、有機酸類和揮發性成分等，藥理學研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤、預防心腦血管老化、淡化肝斑、抗炎、抗氧化和抗衰老等功效。
圖 1 西府海棠果實
本研究以西府海棠果實對酪氨酸酶的活性影響，結合HPLC指紋圖譜構建“譜-效模型”，通過譜-效關系篩選出活性物質，并采用成分敲出法和UPLC-MS/MS法對目標成分進行結構鑒定。
Fig.2 HPLC fingerprints of M. micromalus fruit and its reference fingerprint （R）
Fig.3 Standardization regression coefficient of PLSA model of characteristics common peak-tyrosinase inhibition activity.
Fig.4 The high resolution mass spectra of Peak 2 knocked-out component.
Fig.5 The high resolution mass spectra of Peak 8 knocked-out component.
Fig.6 The MS/MS fragmentation pathway of p-Coumaric acid （a）、
4-O-β-Glucopyranosyl-cis-coumaric acid （c）。
在此基礎上，采用酶促反應動力學探討敲出成分對酪氨酸酶催化反應的影響及動力學模型分析，并借助分子對接技術預測活性成分和酪氨酸酶的結合模式，闡明西府海棠果實中對酪氨酸酶起抑制/激活作用的活性成分及其作用機制。
Fig. 7 Lineweaver-Burk plots of tyrosinase after the addition of p-coumaric acid （a），phloridzin （b），quercetin-3-O-α-rhamnoside （c） and 4-O-β-glucopyranosyl-cis-coumaric acid （d）。
Fig. 8 Molecular docking interaction of tyrosinase with p-coumaric acid（a）， phloridzin（b），quercetin-3-O-α-rhamnoside（c） and 4-O-β-glucopyranosyl-cis-coumaric acid（d）
Note: （a, b, c, d） Plane projection diagram of the interaction between compound and tyrosinase.
本研究通過譜-效關系研究發現，在濃度0.5 g/mL時，西府海棠果實實對酪氨酸酶活性的抑制作用效果最好；PLS-DA分析顯示，西府海棠果實特征色譜中P2、P3、P5和P6對酪氨酸酶活性的抑制作用呈正相關（R＞0.1）；P8和P9對酪氨酸酶活性的抑制作用呈負相關（R＜-0.1）。通過UPLC-MS/MS法鑒定P2、P6、P8、P10、P11和12分別為對香豆酸、阿魏酸-酰基葡萄糖苷、香豆酸-4-O-葡萄糖苷、根皮素-2'-木糖葡萄糖苷、根皮苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。酪氨酸酶動力學實驗結果表明：對香豆酸（P2）、根皮苷（P11） （P11＞0.50 mmol/L）對酪氨酸酶具有競爭性抑制作用，其中根皮苷濃度小于0.25 mmol/L時，具有混合性抑制作用。香豆酸-4-O-葡萄糖苷（P8）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）分別在0~9 mmol/L、0.3-11 mmol/L的濃度范圍內主要表現為非競爭性激活類型，而槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）為混合型激活類型。酪氨酸酶分子對接結果表明：對香豆酸（P2）、香豆酸-4-O-葡萄糖苷（P8）、根皮苷（P11）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（P12）位于酶的疏水口袋活性中心，與酪氨酸酶殘基以氫鍵結合，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同維持復合物的結構。
利用譜效關系，成分敲出及高分辨質譜鑒定技術快速鑒定復雜中藥體系活性成分，闡述中藥整體觀，挖掘活性成分/成分群領域，本團隊已形成了成熟的研究策略。研究成果先后發表在 Food and Chemical Toxicology （https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.110754）；
Food Science and Human Wellness （https://doi.org/10.1016/j.fshw.2021.02.019）；
Food and Chemical Toxicology （https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.110754）；
International Journal of Molecular Sciences （https://doi.org/10.3390/ijms19113439）；
Frontiers in pharmacology （https://doi.org/10.3389/fphar.2020.01342）等雜志。并以此技術創新集成，獲得2020年河南省科學技術進步二等獎。
日期：2021-03-09
