近日，南京農業大學吳益東教授團隊在重要國際學術期刊PLoS Genetics上發表題為“Genome mapping coupled with CRISPR gene editing reveals a P450 gene confers avermectin resistance in the beet armyworm”的最新研究成果。該研究構建了首個高質量染色體水平的甜菜夜蛾參考基因組，通過基因圖位克隆、基因編輯和體外功能表達等多種手段揭示了甜菜夜蛾細胞色素P450氧化酶通過單個氨基酸突變對阿維菌素類殺蟲劑產生抗性的新機制。
害蟲抗藥性是農業生產的全球性制約因素之一，快速鑒定抗藥性基因對于抗性害蟲種群的監測和治理至關重要。細胞色素P450是昆蟲體內一類重要解毒代謝酶，昆蟲能夠過量表達一個或多個P450解毒酶對殺蟲劑產生抗性。每種昆蟲具有100個左右的P450基因，因此P450抗性基因的鑒定和抗藥性機制解析極具挑戰性。
甜菜夜蛾是一種間歇性暴發成災的全球性害蟲，由于長期依靠噴灑殺蟲劑進行防治，該害蟲已對包括阿維菌素在內的多種殺蟲劑產生了高水平抗藥性。為了破譯甜菜夜蛾對阿維菌素產生抗性的分子機制，本研究首先利用Illumina和PacBio測序技術獲得了甜菜夜蛾染色體水平基因組，并構建遺傳作圖群體將抗性基因定位于在17號染色體15-16 Mbp區間、由9個CYP9A亞家族P450基因首尾相連組成的基因簇（圖1）。
為了確定抗性基因，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術對甜菜夜蛾抗性品系體內長達130 kb 的CYP9A基因簇進行整體敲除和分段敲除，通過反向遺傳證據鎖定了該基因簇中CYP9A186基因與甜菜夜蛾對阿維菌素的高水平抗性具有因果關系（圖2）。
進一步分析發現，甜菜夜蛾抗性品系CYP9A186在底物識別區域SRS1中攜帶F116V突變。通過離體功能表達研究證實，CYP9A186野生型不能代謝阿維菌素，而CYP9A186突變型（F116V）獲得了對阿維菌素的解毒代謝能力，從而使甜菜夜蛾抗性品系對阿維菌素產生高水平抗性（圖3）。
本研究運用基因編輯與遺傳定位相結合的新策略，快速鑒定了介導殺蟲劑抗性的P450基因，明確P450基因通過功能獲得性突變（gain of function mutation）導致害蟲抗藥性發生的分子機制。該研究成果不僅為甜菜夜蛾代謝抗性基因監測預警、抗性治理策略制定以及新型殺蟲劑研發提供重要依據，同時為昆蟲抗藥性新基因的快速鑒定提供了一套可復制的解決方案。
南京農業大學植物保護學院吳益東教授、楊亦樺教授為論文共同通訊作者，左亞運博士為第一作者，張峰教授、施雨博士、管放博士、張建鵬博士生以及丹麥哥本哈根大學René Feyereisen教授和美國干旱地區農業研究中心Jeffrey A. Fabrick研究員參與了此項研究。該研究得到了國家自然基金項目（31572030）和國家科技基礎資源調查計劃項目（2018FY101103）的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009680
日期：2021-07-14
害蟲抗藥性是農業生產的全球性制約因素之一，快速鑒定抗藥性基因對于抗性害蟲種群的監測和治理至關重要。細胞色素P450是昆蟲體內一類重要解毒代謝酶，昆蟲能夠過量表達一個或多個P450解毒酶對殺蟲劑產生抗性。每種昆蟲具有100個左右的P450基因，因此P450抗性基因的鑒定和抗藥性機制解析極具挑戰性。
甜菜夜蛾是一種間歇性暴發成災的全球性害蟲，由于長期依靠噴灑殺蟲劑進行防治，該害蟲已對包括阿維菌素在內的多種殺蟲劑產生了高水平抗藥性。為了破譯甜菜夜蛾對阿維菌素產生抗性的分子機制，本研究首先利用Illumina和PacBio測序技術獲得了甜菜夜蛾染色體水平基因組，并構建遺傳作圖群體將抗性基因定位于在17號染色體15-16 Mbp區間、由9個CYP9A亞家族P450基因首尾相連組成的基因簇（圖1）。
為了確定抗性基因，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術對甜菜夜蛾抗性品系體內長達130 kb 的CYP9A基因簇進行整體敲除和分段敲除，通過反向遺傳證據鎖定了該基因簇中CYP9A186基因與甜菜夜蛾對阿維菌素的高水平抗性具有因果關系（圖2）。
進一步分析發現，甜菜夜蛾抗性品系CYP9A186在底物識別區域SRS1中攜帶F116V突變。通過離體功能表達研究證實，CYP9A186野生型不能代謝阿維菌素，而CYP9A186突變型（F116V）獲得了對阿維菌素的解毒代謝能力，從而使甜菜夜蛾抗性品系對阿維菌素產生高水平抗性（圖3）。
本研究運用基因編輯與遺傳定位相結合的新策略，快速鑒定了介導殺蟲劑抗性的P450基因，明確P450基因通過功能獲得性突變（gain of function mutation）導致害蟲抗藥性發生的分子機制。該研究成果不僅為甜菜夜蛾代謝抗性基因監測預警、抗性治理策略制定以及新型殺蟲劑研發提供重要依據，同時為昆蟲抗藥性新基因的快速鑒定提供了一套可復制的解決方案。
南京農業大學植物保護學院吳益東教授、楊亦樺教授為論文共同通訊作者，左亞運博士為第一作者，張峰教授、施雨博士、管放博士、張建鵬博士生以及丹麥哥本哈根大學René Feyereisen教授和美國干旱地區農業研究中心Jeffrey A. Fabrick研究員參與了此項研究。該研究得到了國家自然基金項目（31572030）和國家科技基礎資源調查計劃項目（2018FY101103）的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009680
日期：2021-07-14
