近日，Nature Communications在線發表了江南大學未來食品科學中心和生物工程學院陳堅院士團隊劉龍教授課題組的研究成果“De novo biosynthesis of rubusoside and rebaudiosides in engineered yeasts”（Xu et al., Nature Communications. 2022. 13:3040） （https://www.nature.com/articles/s41467-022-30826-2）。劉龍教授為論文的通訊作者，我院2018級博士生徐雅夢為論文第一作者。
隨著高糖、高熱量飲食引發的糖尿病、高血壓、肥胖等一系列健康問題被廣泛關注，具有高甜度、低熱值等特點的甜味劑的開發已成為近年來的研究熱點。其中，植物來源的天然低熱甜味劑（如甜茶苷、萊鮑迪苷等）因具有安全、穩定等優點備受消費者的青睞，目前已被廣泛應用于食品和飲品等行業。
甜菊糖苷是從甜葉菊中提取的一類天然甜味劑，根據其側鏈上葡萄糖基位置和個數的不同，可分為甜茶苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C等60余種類型。目前市場上的甜菊糖苷主要來源于植物提取。但植物中甜菊糖苷的豐度低，植物生長具有季節依賴性，且提取過程復雜，這限制了甜菊糖苷的大規模生產。與傳統的植物提取法相比，微生物發酵法能夠克服以上缺點，有效地提高甜菊糖苷的合成效率。因此，通過構建微生物底盤細胞，以廉價碳源為底物從頭合成甜菊糖苷具有重要意義。
為此，本研究在釀酒酵母中重構甜茶苷代謝合成途徑。首先，基于合成生物學中的代謝網絡模塊化方法將甜茶苷合成途徑分為5個模塊，包括萜類合成模塊、P450s模塊、甜茶苷合成模塊、UDP-葡萄糖合成模塊和甜茶苷轉運模塊。通過優化萜類合成模塊，并引入P450s模塊和甜茶苷合成模塊，成功獲得甜茶苷產量為4.5 mg/L的生產底盤（圖1）。其次，通過改造P450酶、構建人工底物代謝通道、擴大內質網等策略解除P450s模塊中的限速步驟，甜茶苷產量提高至67.7 mg/L（圖2）。隨后，結合蛋白質結構預測、分子對接等技術開發了一種針對甜茶苷轉運模塊外排泵篩選的快捷方法。通過外排泵抑制實驗判定甜茶苷外排泵屬于ABC外排泵家族；經實驗驗證PDR11為釀酒酵母中甜茶苷的外排泵；強化甜茶苷轉運模塊后，產量提高至155.6 mg/L；同時，本研究通過強化MSN4表達提高工程菌株對甜茶苷的適應性后，甜茶苷的產量達到205.5 mg/L（圖3）。最后，針對甜茶苷合成途徑構建了基因組規模代謝網絡模型，并應用OptKnock算法預測甜茶苷生產底盤中的基因敲除靶點，發現UDP-葡萄糖供給不足是限制甜茶苷高效合成的一個關鍵因素，通過UDP-葡萄糖合成模塊進行優化與代謝流再分配后，甜茶苷在搖瓶中的產量達到302.1 mg/L，經15-L發酵罐放大培養后，甜茶苷產量達到1368.6 mg/L（圖4）。
為了進一步驗證上述底盤細胞的普適性，本研究基于甜茶苷生產底盤，引入萊鮑迪苷合成途徑，成功實現萊鮑迪苷的從頭合成。隨后，基于Rosette軟件對關鍵限速酶EUGT11進行半理性設計，并通過表達元件改造與動態調控進行代謝流的優化，萊鮑迪苷（RA、RD、RM）在15-L發酵罐中產量達到132.7 mg/L（圖5）。總之，本研究通過系統代謝工程策略構建了一株高產甜茶苷和萊鮑迪苷的生產底盤細胞，所采用的研究策略對于其他天然產物合成底盤細胞的構建具有借鑒意義。上述研究得到了國家重點研發項目（2020YFA0908300）、國家自然科學基金（32021005、31930085、31870069）等項目的資助。
日期：2022-06-07
隨著高糖、高熱量飲食引發的糖尿病、高血壓、肥胖等一系列健康問題被廣泛關注，具有高甜度、低熱值等特點的甜味劑的開發已成為近年來的研究熱點。其中，植物來源的天然低熱甜味劑（如甜茶苷、萊鮑迪苷等）因具有安全、穩定等優點備受消費者的青睞，目前已被廣泛應用于食品和飲品等行業。
甜菊糖苷是從甜葉菊中提取的一類天然甜味劑，根據其側鏈上葡萄糖基位置和個數的不同，可分為甜茶苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C等60余種類型。目前市場上的甜菊糖苷主要來源于植物提取。但植物中甜菊糖苷的豐度低，植物生長具有季節依賴性，且提取過程復雜，這限制了甜菊糖苷的大規模生產。與傳統的植物提取法相比，微生物發酵法能夠克服以上缺點，有效地提高甜菊糖苷的合成效率。因此，通過構建微生物底盤細胞，以廉價碳源為底物從頭合成甜菊糖苷具有重要意義。
為此，本研究在釀酒酵母中重構甜茶苷代謝合成途徑。首先，基于合成生物學中的代謝網絡模塊化方法將甜茶苷合成途徑分為5個模塊，包括萜類合成模塊、P450s模塊、甜茶苷合成模塊、UDP-葡萄糖合成模塊和甜茶苷轉運模塊。通過優化萜類合成模塊，并引入P450s模塊和甜茶苷合成模塊，成功獲得甜茶苷產量為4.5 mg/L的生產底盤（圖1）。其次，通過改造P450酶、構建人工底物代謝通道、擴大內質網等策略解除P450s模塊中的限速步驟，甜茶苷產量提高至67.7 mg/L（圖2）。隨后，結合蛋白質結構預測、分子對接等技術開發了一種針對甜茶苷轉運模塊外排泵篩選的快捷方法。通過外排泵抑制實驗判定甜茶苷外排泵屬于ABC外排泵家族；經實驗驗證PDR11為釀酒酵母中甜茶苷的外排泵；強化甜茶苷轉運模塊后，產量提高至155.6 mg/L；同時，本研究通過強化MSN4表達提高工程菌株對甜茶苷的適應性后，甜茶苷的產量達到205.5 mg/L（圖3）。最后，針對甜茶苷合成途徑構建了基因組規模代謝網絡模型，并應用OptKnock算法預測甜茶苷生產底盤中的基因敲除靶點，發現UDP-葡萄糖供給不足是限制甜茶苷高效合成的一個關鍵因素，通過UDP-葡萄糖合成模塊進行優化與代謝流再分配后，甜茶苷在搖瓶中的產量達到302.1 mg/L，經15-L發酵罐放大培養后，甜茶苷產量達到1368.6 mg/L（圖4）。
為了進一步驗證上述底盤細胞的普適性，本研究基于甜茶苷生產底盤，引入萊鮑迪苷合成途徑，成功實現萊鮑迪苷的從頭合成。隨后，基于Rosette軟件對關鍵限速酶EUGT11進行半理性設計，并通過表達元件改造與動態調控進行代謝流的優化，萊鮑迪苷（RA、RD、RM）在15-L發酵罐中產量達到132.7 mg/L（圖5）。總之，本研究通過系統代謝工程策略構建了一株高產甜茶苷和萊鮑迪苷的生產底盤細胞，所采用的研究策略對于其他天然產物合成底盤細胞的構建具有借鑒意義。上述研究得到了國家重點研發項目（2020YFA0908300）、國家自然科學基金（32021005、31930085、31870069）等項目的資助。
日期：2022-06-07
