生物薄膜Biofilm RNA提取試劑盒

生物薄膜在很多方面特性與土壤非常類似，如微生物群落混雜、細菌密度差異大、水分含量、化學組成和抑制因子。而富含有腐植酸抑制物、金屬離子、鹽和大量的多糖，這些方面也很像土壤，并且會影響核酸的提取。然而，生物薄膜和土壤的基本組成成分還是有很大的區別，所以提取DNA和RNA時，還需要另外加入一些處理手段。

下面介紹幾個處理生物薄膜前需要考慮的東西。

樣品收集:

采集生物薄膜樣品可以很簡單，刮下巖石上粘滑的一層、切下微生物墊（Microbial Mat）一小塊，或連同生物薄膜和生長的基質一起采回來，通過渦旋、研磨均質、超聲波或化學/酶處理，分離其中的生物薄膜物質。收集生長在巖石、淋浴蓮蓬頭、管道、牙齒上的生物薄膜相對比較麻煩點，通常采用超聲波、研磨均質或刮取法分離微生物群落。化學和酶處理很少用，因為它們不能適用于所有類型的胞外混合物。

胞外聚合物EPS:

細菌分泌的胞外聚合物不但是結構上的需要，還是抵抗環境壓力的利器，同時它也抵抗抗生素或裂解緩沖液的使用。越老越成熟的生物薄膜EPS含量越高，硬度也越大。越粘稠的生物薄膜含有更多的沉積物、鹽和礦物沉淀。裂解條件很好的情況下，加樣量不用太多。一個地點多采幾個樣，微環境的差異有可能影響微生物種群的結構。較薄的生物薄膜里頭微生物相對較少，需要多加樣。另外，若生長基質本身比較細膩，可以連同生物薄膜一起放進Bead Beating Tube中進行提取。

裂解:

保證充分的裂解是處理生物薄膜難的一個部分。微生物墊使用強力的珠磨研磨機可以取得很好的均質效果，而富含EPS的樣品經過長時間珠磨研磨后，裂解物會變得非常粘稠。隨著研磨時間增加，可轉移出來用于下一個步驟的裂解物就大幅減少。終影響到核酸提取得率。而在渦旋儀上渦旋振蕩則不會出現這種請款。使用PowerBiofilm™ 裂解緩沖液處理富含EPS的樣品，10min的普通渦旋振蕩可以獲得高速珠磨研磨機差不多的提取得率。

抑制因子Inhibitors:

就算裂解步驟再成功，也避免不了降解多糖、腐植酸及其它/無機成分的污染。其中一個去處降解多糖等物質的辦法是在裂解完成后使用IRT技術（抑制因子去除技術）。根據裂解物的顏色和粘稠度（腐植酸等抑制因子水平的指標），IRT的步驟可以做修改。對于比較清亮的裂解物或已知EPS較少的樣品（當然，也不那么粘稠），可以減少抑制因子去除溶液的使用量。相反，呈棕色富含大量腐植酸的樣品需要更多的抑制因子去除溶液。我們給出了兩種抑制因子去除溶液的使用量，因為大量使用來去除抑制因子的同時也會去除掉部分核酸。所以使用適當的溶液量去抑制因子，是獲得得率化的關鍵。

為了化無抑制因子核酸的得率，需要平衡EPS含量與細菌密度。下面的列表會隨著對生物薄膜的繼續深入研究或遇到新類型有趣的樣品而可能增加。

1）少加樣。當使用2ml Bead Tubes小量提取時，加樣量控制在0.05-0.2g。有些研究者通過自己實驗室長期摸索優化，加樣量有達到0.25-0.3g的。使用超過建議加樣量常常會導致提不到核酸（見第三點）。建議加樣量不是指導范圍而是裂解溶液化學物的處理范圍。過量加樣會影響生物薄膜生長基質的去除和細胞裂解。

2）使用試劑盒提供研磨珠套管。PowerBiofilm 的研磨珠套管是經過專門設計適應裂解溶液化學物工作的。它不是簡單的研磨珠混搭。外容器Tube本身非常堅硬，可適用于普通的渦旋振蕩和強力高速珠磨研磨機，不會中途破裂。請不要把研磨珠轉移到其它Tube管中使用。有些人未曾用過不透明的研磨珠套管，不過把離心后碎片等會沉淀下來，轉移上清不會很困難。去嘗試，如果有困難請隨時聯系我們。

3）不要超時研磨。使用你實驗室常規研磨均質設備和標準設置不一定，有可能過分研磨。根據我們的經驗，加長樣品研磨時間或更大的研磨強度并不能提高得率。隨著研磨時間的延長和強度的增加，多糖和其它/無機成分容易形成粘稠的裂解物。絕大多數這類物質不可溶，且會吸附核酸，導致核酸丟失。如果研磨完畢可轉移的裂解物少于400μl，那么就是研磨太過了。高速研磨30s比較合適。

4）使用適量洗脫液。這條適用于使用二氧化硅濾膜過濾柱進行洗脫。的洗脫液體積是100μl。這個量可讓核酸充分洗脫下來。均勻加到濾膜上的話，50μl小量也還能保證核酸洗脫效率，不過100μl能獲得充分洗脫。使用小于50μl會嚴重影響核酸得率。請記住，稀釋的核酸可通過濃縮縮小體積。

5）不要以為所有生物薄膜（biofilm）和生物墊（biomats）都差不多。有些生物薄膜雜質很多微生物很少，得率遠沒有想象中的那么高。若洗脫后分光光度計測不出來DNA或RNA，加樣量沒有超出建議值，也沒有研磨太過，也許只是核酸濃度非常低。你仍然有可能通過PCR檢測得到（見第六點）。若對你的生物薄膜樣品不太了解，與預期得率差異很大，請聯系我們，或者可以給出更多優化建議。關于一些生物薄膜和生物墊的常規得率，點擊這里（biofilm_apnote）。

6）凝膠電泳和PCR共同評估核酸。使用紫外光檢測得率，許多因素會影響讀數的準確性。腐植酸和污染的RNA可明顯推高A260。DNA碎片比完整DNA片段讀數要高。凝膠電泳可更好檢驗分光光度計的結果。因為PowerBiofilm使用了IRT技術（抑制因子去除技術），獲得的核酸非常純凈，所以若讀數較低，也要比未經有效純化DNA和RNA得到的結果更準確。如果凝膠電泳看不到條帶，嘗試PCR擴增。使用了IRT技術的PowerBiofilm Kit能保證擴增的成功率，這點明顯區別于其它提取方法。

小結：

希望上述的幾條建議能幫助正在努力奮斗提取此珍貴樣品生物學信息的你。花費大量時間和長途跋涉采樣辛苦勞累，我們懂！希望你們試驗能成功。后面會發布更多技術要領。也歡迎你與我們分享處理生物薄膜的心得和技巧。

責權聲明：

①本版塊的所有文章及圖片均為客戶自行編輯，其版權為客戶所有，客戶需保證其編輯的文章及圖片均無侵犯任何第三方的合法權益，如被第三方維權，由客戶承擔全部責任；
② 本網站僅為展示平臺，如要轉載，請與我網站聯系協助獲得授權；
③發布內容如有侵權，請及時聯系我網站進行刪除。
※ 聯系電話：400-854-6788