Pfu DNA Polymerase

 Pfu DNA Polymerase簡稱Pfu酶，是常用的高保真DNA聚合酶之一。
    來源：本Pfu DNA Polymerase為recombinant Pfu DNA Polymerase，通過大腸桿菌表達純化獲得，和純化獲得的天然Pfu DNA Polymerase在各方面的性質相同。
    Pfu DNA Polymerase是一種來源于嗜熱菌Pyrococcus furiosus的高度熱穩定的DNA聚合酶。Pfu酶的分子量為90kDa。Pfu酶可以催化5'至3'方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合。和Taq酶不同，Pfu酶有3'至5'的外切酶活性(proofreading activity)。另外，Pfu酶有5'至3'外切酶活性，但Pfu酶沒有反轉錄酶活性。
    由于Pfu酶有3'至5'的外切酶活性，因此在PCR擴增過程中出錯的幾率大大降低，出錯率為2.6×10^-6 per nt per cycle。Pfu的出錯率不僅遠遠低于Taq酶，也低于一些其它的高保真DNA聚合酶例如Vent、DeepVent、Pwo、Tli等，因此Pfu酶通常作為首先的高保真DNA聚合酶。 
    活性定義：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a polynucleotide fraction(adsorbed on DE-81)in 30 min at 72℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 20 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃), 2 mM MgSO₄, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 0.1% (v/v)Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [³H]-dTTP.
    用途：高保真PCR (high fidelity PCR)、點突變、雙平端PCR克隆等。Pfu酶擴增出來的DNA片斷為雙平端，可以用于雙平端克隆，但不能用于常規的T載體克隆。dUTP和dITP或含有dUTP和dITP的引物不能用于Pfu酶介導的PCR擴增反應。
    純度：不含DNA內切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規PCR反應要求。
    酶儲存溶液：20 mM Tris-HCl(pH 8.2), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% (v/v) Nonidet P40, 0.1% (v/v) Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
    10×Pfu Buffer(with Mg²⁺)：200 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃), 100 mM (NH₄)₂SO₄, 100 mM KCl, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mg/ml BSA.。
    失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Pfu酶失活。
 

保存條件：
    -20℃保存。
注意事項：
    由于PCR反應非常靈敏可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Pfu酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
    Pfu DNA polymerase在擴增DNA片斷時的出錯率非常低，但其擴增效率也比較低。對于出錯率要求不高的情況，例如RT-PCR進行定量或半定量，推薦使用Taq DNA polymerase。在擴增效率和出錯率需要兼顧的情況，可以選擇BeyoTaq DNA polymerase。在擴增2kb以下DNA片斷時，Pfu酶和Taq酶的擴增效率相近。在準確性要求很高的情況下，須選擇Pfu酶。
    Pfu酶有3'至5'的外切酶活性，在沒有dNTP的情況下可以降解引物。因此Pfu酶一定要加入，并且要在冰浴上操作。
    不能使用Taq酶的PCR Buffer來替代Pfu酶的PCR Buffer。
    為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1. PCR反應體系的設置：
   a. 溶解并混勻PCR反應所需的各種溶液。將Pfu DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內。
   b. 參考下表在冰浴上設置PCR反應(如果有多個類似的PCR反應，可以先配制大體積的包含水、
      buffer、dNTP和Pfu酶的混合物，然后分裝到各PCR反應管內。根據情況，有時混合物中可以包括
      引物)。
c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數秒，使液體積聚于管底。
   d. 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴礦物油
      (mineral oil，ST275)。
   e. 各設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。
2. PCR反應參數的設置可以參考如下示例：
      STEP1(起始變性): 94℃ 3min
      STEP2(變性): 94℃ 30sec
      STEP3(退火): 55℃ 30sec
      STEP4(延伸): 72℃ 2min
      STEP5(循環): Go To STEP2 for 30 cycles
      STEP6(終延伸): 72℃ 10min
      STEP6(臨時保存): 4℃ forever
   a. PCR反應的設置需根據模板、引物、PCR產物的長度和GC含量等條件的不同設定不同的PCR反應條件
      包括溫度、時間和循環數等。
   b. STEP4(延伸)的時間設置需根據PCR產物的長度進行設置，通常每kb產物的延伸時間為2分鐘。例如
      PCR產物的長度為1kb，則延伸時間可以設置為2分鐘，PCR產物的長度為2kb，則延伸時間可以設置
      為4分鐘，以此類推。
   c. 對于初次進行的PCR，為盡量確保可以擴增出預期的PCR產物，可以把循環數設置為35。對于需進
      行半定量或定量的PCR反應循環數一定要進行適當優化，使PCR反應沒有達到平臺期。

常見問題：
1. PCR產物非常少或沒有特異性條帶。
   a. 引物設計不佳是PCR過程中常見的問題。請選擇適當的引物設計軟件進行引物設計，注意引物的
      GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物
      中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特
      異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以
      考慮更換引物。
   b. 待擴增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高
      GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應地根據GC-rich buffer的要求或說明調整PCR反應參數
      的設置。
   c. 長片斷擴增。盡管Pfu DNA polymerase可以擴增較長的DNA片斷，但大多數時候比較適合擴增5kb
      以下的片斷，更長片斷的擴增推薦使用其它更適合長片斷擴增的DNA聚合酶。
   d. PCR反應設置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設置PCR反應。
   e. 由于引物存在一定的二級結構或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時
      可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或50℃的方法，使退火
      更加充分。
   f. 退火溫度不佳，需要優化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的
      溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索的退火溫度。
   g. 延伸時間不足。可按照每1kb片斷延伸3分鐘進行設置，對于較難擴增的片斷可以設置為每1kb片斷
      延伸5分鐘。
   h. 待擴增片斷GC含量較高或長度較長，變性不夠充分?？梢哉{節起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃
      2-4min。
   i. 在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現問題。
   j. 循環數不足，適當延長PCR的循環數。通常循環數不必超過40，常用的循環數范圍為25-35。
   k. 模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設
      計的PCR引物內側再設計一對PCR引物，然后對次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這
      樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比
      較簡單地用原有引物對次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不
      能去除非特異性條帶。
   l. 模板中含有抑制PCR反應的物質，可以用適當的DNA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
   m. 當產生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
   n. 擴增效率偏低。選擇可以兼顧擴增效率和準確率的DNA polymerase，例如BeyoTaq DNA
      polymerase等。
   o. 注意設置適當的陽性對照和陰性對照通常會有很大幫助。

 

 

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