維生素D簡介
維生素D 為固醇類衍生物，具抗佝僂病作用，又稱抗佝僂病維生素。維生素D 均為不同的維生素D 原經紫外照射后的衍生物，共五種化合物，其中與人類健康密切相關的有維生素D2（麥角鈣化醇）和維生素D3（膽鈣化醇)。它存在于部分天然食物中，同時人體皮下儲存有從膽固醇生成的7-脫氫膽固醇，受紫外線的照射后，可轉變為維生素D，因此適當的日光浴也可以滿足人體對維生素D 的需要。
逗點生物開發出使用固相萃取法檢測食品中維生素D2、D3 含量，致力于為客戶提供關于維生素D 檢測的有效解決方案。
一實驗目的
本研究利用固相萃取法作為樣品的前處理方法，HPLC法作為分析方法，檢測奶粉中維生素D2、D3的殘留。該方法可簡化樣品的前處理過程，節省有機溶劑的使用，操作簡便。
二實驗目標物
維生素D2(CAS: 50-14-6)、維生素D3(CAS: 67-97-0)。
三應用范圍
本方法適用于奶粉、滴劑中維生素D2、D3殘留的HPLC檢測及確證。
四參考標準
《GB5009.82-2016食品安全國家標準食品中維生素A、D、E的測定》。
五實驗材料
biocomma® Copure® Silica 2000 mg/12 mL(Cat. No. COSIL122000)。
六實驗方法
1.樣品提取
(1)奶粉固體樣品處理
準確稱取2.0 g奶粉置于50 mL離心管中，加入5 mL檸檬酸水溶液（200 g/L），4 mL二甲基亞砜，5 mL甲醇，于振蕩器中振蕩10 min，再加15 mL提取液（正己烷：甲基叔丁基醚=1:1，v/v）振蕩10 min，在4000 r/min下離心5 min，取上清液；向離心管中重新加10 mL提取液，重復提取一次，合并兩次上清液，于50 °C下氮吹至近干，加入5 mL正己烷重新溶解，備用。
(2)滴劑液體樣品處理
取滴劑膠囊一粒，從中剪開置于50 mL離心管中，加入10 mL提取液（乙酸乙酯：正己烷=1:9，v/v）于振蕩器振蕩提取10 min，上清液轉移，向離心管中再加10 mL提取液，重復提取一次，合并兩次上清液，備用。
2.SPE柱凈化
(1)活化：Silica柱使用前用10 mL乙酸乙酯活化，10 mL正己烷平衡。
(2)上樣和洗脫：取備用液加入固相萃取柱中，棄去流出液；取5 mL淋洗液（乙酸乙酯：正己烷=5:95）分兩次淋洗，棄去流出液；抽干小柱；取20 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，于50 °C氮吹至近干（整個上樣、洗脫過程控制流速在1 mL/min內）。
(3)重新溶解：加1 mL甲醇重新溶解、混勻，經0.22 μm濾膜過濾，供上機測試。
3.HPLC條件
設備：Waters Alliance 2695
色譜柱：InertSustain-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)
檢測器：Waters 2996 DAD 紫外檢測器
檢測波長：268 nm
流動相：甲醇：水=98：2
流速：1.0 mL/min
進樣體積：20 μL
七實驗結果
1、1.25 mg/kg各基質中維生素D2、D3的添加回收結果
表1 1.25 mg/kg各基質中維生素D2、D3的添加回收結果
2、添加水平為1.25 mg/kg維生素D2、D3檢測的液相色譜圖
圖1 添加水平為1.25 mg/kg維生素D2、D3檢測的液相色譜圖
結論：本方法平均回收率為89.9 %，RSD為4.3 %，滿足標準要求。
