水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測的固相萃取方法
（Copure ® ALA）
一、實驗目的
本研究利用固相萃取法作為樣品的前處理方法，HPLC法作為分析方法，檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠含量。該方法 可簡化樣品的前處理過程，節(jié)省有機溶劑的使用，操作簡便。
二、實驗目標物
孔雀石綠(CAS:569-64-2) 。
三、應用范圍
本方法適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測的HPLC檢測及確證。
四、參考標準
《GB/T 19857-2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》。
五、實驗材料
biocomma ® Copure ® 酸性氧化鋁固相萃取柱1000mg/3mL(Cat. No. COALA31000)。
六、實驗步驟
1、樣品提取
準確稱取魚肉樣品5.0 g于50 mL離心管1中， 加入1.5 mL 20%的鹽酸羥胺，2.5 mL 1.0 mol/L的對甲苯磺酸溶 液， 5.0 mL乙酸鈉-對甲苯磺酸緩沖液（4.95 g無水乙酸鈉及0.95 g 對-甲苯磺酸于950ml水中，用乙酸調 pH至 4.5，用水定容至1 L），勻漿機均質30 s（10000 r/min）。加入10 mL乙腈，劇烈振搖30 s。加入5 g酸 性氧化鋁，震蕩30 s。離心機離心10 min（3000 r/min）,取上清液轉移至預先加好10 mL水、2 mL二甘醇的離 心管2中。加入10 mL乙腈至離心管1中，重復上述提取一次，合并乙腈層。
離心管2中加入15 mL二氯甲烷，振蕩10 s，離心10 min（3000 r/min），取二氯甲烷層于梨形瓶中。繼續(xù)用
5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重復上述提取一次，合并兩次提取的二氯甲烷層。將提取液45 ℃旋轉蒸發(fā)至1 mL，
再用2.5 mL乙腈溶解，待凈化。
2、SPE柱凈化
(1) 活化：酸性氧化鋁固相萃取柱使用前用5 mL乙腈活化。
(2) 上樣和洗脫：將梨形瓶中的待凈化液轉移至柱中凈化，梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗滌瓶兩次，把洗滌液
依次通過柱子，整個上樣過程保持流速不超過0.6 mL/min，收集全部流出液。
(3) 重新溶解：流出液45 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈定容，過0.45 μm濾膜，待上機測試。
3、HPLC條件
設 備：Waters Alliance 2695
色譜柱 ：Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm，5μm)
檢測器 ：Waters 2487 紫外檢測器
流動相：A：乙腈
B：0.05 mol/L乙酸銨緩沖溶液
洗脫方式：梯度洗脫
表1 梯度洗脫條件
流速：1.2 mL/min
檢測波長：618 nm
進樣體積:50 μL
七、實驗結果
1、0.1 mg/kg魚肉中孔雀石綠的添加回收結果
表2 0.1mg/kg魚肉中孔雀石綠的添加回收結果
2、添加水平為0.1 mg/kg魚肉中孔雀石綠檢測的液相色譜圖
圖1 添加水平為0.1 mg/kg魚肉中孔雀石綠檢測的液相色譜圖
（Copure ® ALA）
一、實驗目的
本研究利用固相萃取法作為樣品的前處理方法，HPLC法作為分析方法，檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠含量。該方法 可簡化樣品的前處理過程，節(jié)省有機溶劑的使用，操作簡便。
二、實驗目標物
孔雀石綠(CAS:569-64-2) 。
三、應用范圍
本方法適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測的HPLC檢測及確證。
四、參考標準
《GB/T 19857-2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》。
五、實驗材料
biocomma ® Copure ® 酸性氧化鋁固相萃取柱1000mg/3mL(Cat. No. COALA31000)。
六、實驗步驟
1、樣品提取
準確稱取魚肉樣品5.0 g于50 mL離心管1中， 加入1.5 mL 20%的鹽酸羥胺，2.5 mL 1.0 mol/L的對甲苯磺酸溶 液， 5.0 mL乙酸鈉-對甲苯磺酸緩沖液（4.95 g無水乙酸鈉及0.95 g 對-甲苯磺酸于950ml水中，用乙酸調 pH至 4.5，用水定容至1 L），勻漿機均質30 s（10000 r/min）。加入10 mL乙腈，劇烈振搖30 s。加入5 g酸 性氧化鋁，震蕩30 s。離心機離心10 min（3000 r/min）,取上清液轉移至預先加好10 mL水、2 mL二甘醇的離 心管2中。加入10 mL乙腈至離心管1中，重復上述提取一次，合并乙腈層。
離心管2中加入15 mL二氯甲烷，振蕩10 s，離心10 min（3000 r/min），取二氯甲烷層于梨形瓶中。繼續(xù)用
5 mL乙腈、10 mL二氯甲烷重復上述提取一次，合并兩次提取的二氯甲烷層。將提取液45 ℃旋轉蒸發(fā)至1 mL，
再用2.5 mL乙腈溶解，待凈化。
2、SPE柱凈化
(1) 活化：酸性氧化鋁固相萃取柱使用前用5 mL乙腈活化。
(2) 上樣和洗脫：將梨形瓶中的待凈化液轉移至柱中凈化，梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗滌瓶兩次，把洗滌液
依次通過柱子，整個上樣過程保持流速不超過0.6 mL/min，收集全部流出液。
(3) 重新溶解：流出液45 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈定容，過0.45 μm濾膜，待上機測試。
3、HPLC條件
設 備：Waters Alliance 2695
色譜柱 ：Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm，5μm)
檢測器 ：Waters 2487 紫外檢測器
流動相：A：乙腈
B：0.05 mol/L乙酸銨緩沖溶液
洗脫方式：梯度洗脫
表1 梯度洗脫條件
流速：1.2 mL/min
檢測波長：618 nm
進樣體積:50 μL
七、實驗結果
1、0.1 mg/kg魚肉中孔雀石綠的添加回收結果
表2 0.1mg/kg魚肉中孔雀石綠的添加回收結果
2、添加水平為0.1 mg/kg魚肉中孔雀石綠檢測的液相色譜圖
圖1 添加水平為0.1 mg/kg魚肉中孔雀石綠檢測的液相色譜圖
