飼料中孔雀石綠檢測的固相萃取方法
（Copure ® ALN/PRS）
一、實驗目的
本研究利用固相萃取法作為樣品的前處理方法，HPLC法作為分析方法，檢測水產品中孔雀石綠含量。該方法 可簡化樣品的前處理過程，節省有機溶劑的使用，操作簡便。
二、實驗目標物
孔雀石綠(CAS:569-64-2)
三、應用范圍
本方法適用于水產品中孔雀石綠的檢測的HPLC檢測及確證。
四、參考標準
《NY/T 1756-2012 飼料中孔雀石綠的測定》。
五、實驗材料
biocomma ® Copure ®中性氧化鋁固相萃取柱1g/3mL(Cat.No.COALN31000)、biocomma Copure PRS固相萃取柱500mg/3mL(Cat.No.COPRS3500)。
六、實驗方法
1、樣品提取
準確稱取樣品5.0 g于50 mL離心管中加入1.5 mL 20%的鹽酸羥胺，1.0 mol/L的對甲苯磺酸2 mL，5.0 mL乙酸 鈉-對甲苯磺酸緩沖液(PH 4.5)，加入20 mL乙腈，加入2 g中性氧化鋁，震蕩2 min，超聲30 min，離心機離心 5 min(4000 r/min)，取上清液轉移至分液漏斗中。加入20 mL乙腈至離心管中，重復上述提取一次，合并乙腈 層。分液漏斗中加入50 mL氯化鈉，50 mL二氯甲烷，震搖10 s，靜置分層，取二氯甲烷層于梨形瓶中。繼續用 20 mL二氯甲烷重復上述提取一次，合并兩次提取的二氯甲烷層。梨形瓶35 ℃旋轉蒸發至近干，再用5 mL乙腈溶 解，備用。
2、SPE柱凈化 (1)活化：按照中性氧化鋁柱在上，PRS柱在下順序將兩柱串聯，固相萃取柱使用前使用5 mL乙腈活化。 (2)上樣和洗脫：將備用液轉移至中性氧化鋁柱中凈化，梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗滌瓶兩次，洗滌液轉移 至中性氧化鋁柱內，取5 mL乙腈洗滌小柱，保持流速1 mL/min。再棄去流出液，棄去中性氧化鋁柱，
PRS柱使用2 mL乙腈-乙酸鈉緩沖液(6:4, v/v)、1 mL 20%鹽酸羥胺-甲醇溶液(1:99, v/v)洗脫，收集洗脫液。 (3)重新溶解：洗脫液用乙腈-乙酸鈉緩沖液（6:4, v/v）定容到3 mL，過0.45 μm濾膜，待上機測試。
3、HPLC條件
設 備：Waters Alliance 2695
色譜柱 ：Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm，5 μm) 檢測器 ：Waters 2487 紫外檢測器
流動相：A:乙腈 B:0.05mol/L乙酸銨緩沖溶液 洗脫方式：梯度洗脫
表1 梯度洗脫條件
流速：1.2 mL/min 檢測波長：618 nm 進樣體積:50 μL
七、實驗結果
1、 0.3mg/kg魚肉基質中孔雀石綠的添加回收結果
表2 0.3mg/kg魚肉基質中孔雀石綠的添加回收結果
2、 添加水平為0.3mg/kg魚肉中孔雀石綠檢測色譜圖
圖1 添加水平為0.3mg/kg魚肉中孔雀石綠檢測色譜圖
（Copure ® ALN/PRS）
一、實驗目的
本研究利用固相萃取法作為樣品的前處理方法，HPLC法作為分析方法，檢測水產品中孔雀石綠含量。該方法 可簡化樣品的前處理過程，節省有機溶劑的使用，操作簡便。
二、實驗目標物
孔雀石綠(CAS:569-64-2)
三、應用范圍
本方法適用于水產品中孔雀石綠的檢測的HPLC檢測及確證。
四、參考標準
《NY/T 1756-2012 飼料中孔雀石綠的測定》。
五、實驗材料
biocomma ® Copure ®中性氧化鋁固相萃取柱1g/3mL(Cat.No.COALN31000)、biocomma Copure PRS固相萃取柱500mg/3mL(Cat.No.COPRS3500)。
六、實驗方法
1、樣品提取
準確稱取樣品5.0 g于50 mL離心管中加入1.5 mL 20%的鹽酸羥胺，1.0 mol/L的對甲苯磺酸2 mL，5.0 mL乙酸 鈉-對甲苯磺酸緩沖液(PH 4.5)，加入20 mL乙腈，加入2 g中性氧化鋁，震蕩2 min，超聲30 min，離心機離心 5 min(4000 r/min)，取上清液轉移至分液漏斗中。加入20 mL乙腈至離心管中，重復上述提取一次，合并乙腈 層。分液漏斗中加入50 mL氯化鈉，50 mL二氯甲烷，震搖10 s，靜置分層，取二氯甲烷層于梨形瓶中。繼續用 20 mL二氯甲烷重復上述提取一次，合并兩次提取的二氯甲烷層。梨形瓶35 ℃旋轉蒸發至近干，再用5 mL乙腈溶 解，備用。
2、SPE柱凈化 (1)活化：按照中性氧化鋁柱在上，PRS柱在下順序將兩柱串聯，固相萃取柱使用前使用5 mL乙腈活化。 (2)上樣和洗脫：將備用液轉移至中性氧化鋁柱中凈化，梨形瓶使用2.5 mL×2的乙腈洗滌瓶兩次，洗滌液轉移 至中性氧化鋁柱內，取5 mL乙腈洗滌小柱，保持流速1 mL/min。再棄去流出液，棄去中性氧化鋁柱，
PRS柱使用2 mL乙腈-乙酸鈉緩沖液(6:4, v/v)、1 mL 20%鹽酸羥胺-甲醇溶液(1:99, v/v)洗脫，收集洗脫液。 (3)重新溶解：洗脫液用乙腈-乙酸鈉緩沖液（6:4, v/v）定容到3 mL，過0.45 μm濾膜，待上機測試。
3、HPLC條件
設 備：Waters Alliance 2695
色譜柱 ：Welch Ultimate XB-C18 (4.6×250 mm，5 μm) 檢測器 ：Waters 2487 紫外檢測器
流動相：A:乙腈 B:0.05mol/L乙酸銨緩沖溶液 洗脫方式：梯度洗脫
表1 梯度洗脫條件
流速：1.2 mL/min 檢測波長：618 nm 進樣體積:50 μL
七、實驗結果
1、 0.3mg/kg魚肉基質中孔雀石綠的添加回收結果
表2 0.3mg/kg魚肉基質中孔雀石綠的添加回收結果
2、 添加水平為0.3mg/kg魚肉中孔雀石綠檢測色譜圖
圖1 添加水平為0.3mg/kg魚肉中孔雀石綠檢測色譜圖
