檸檬酸桿菌的檢驗方法及結果判斷

  檸檬酸桿菌（Citrobacter），革蘭氏陰性兼性厭氧菌。直桿菌、直徑約1.0μm，長2.0μm~6.0μm。有呼吸和發酵兩種代謝類型。氧化酶陰性，動力試驗、ONPG試驗陽性，能利用檸檬酸鹽，能夠液化明膠，DNA酶試驗和V-P試驗陰性。根據《伯杰氏細菌學分類手冊》，檸檬酸桿菌屬分為弗氏檸檬酸桿菌（C.freundii）、科氏檸檬酸桿菌（C.diversus）和無丙二酸鹽檸檬酸桿菌（C.amalonaticus）三個種。

二、參考標準；

  《SN/T 2552.6-2010 乳與乳制品衛生微生物學檢驗方法 第6部分：檸檬酸桿菌檢驗》

三、檢測步驟及結果判斷

  3.1 增菌

  無菌稱取樣品100g，10g和1g各三份分別加入2000mL、250mL和100mL樣品稀釋瓶中，加入9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水（1:10稀釋），或者將樣品直接稱量到裝有9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水的樣品稀釋瓶中，振搖使樣品充分混勻，36℃±1℃培養18h～24h。

  分別移取培養18h~24h的懸液各10mL加入90mL四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）中，36℃±1℃培養18h～24h。

  四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）檢驗原理：

  蛋白胨和牛肉粉提供碳源、氮源和維生素，滿足細菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；碳酸鈣能中和細菌產酸及吸收有毒的代謝產物；硫代硫酸鈉和四硫磺酸鈉結合可抑制腸道共生菌（四硫磺酸鈉是在培養基加入碘和碘化鉀時形成），而具有四硫磺酸鈉還原酶的細菌能在此培養基中繁殖；膽鹽和煌綠可抑制大腸群菌和其它革蘭氏陽性細菌。

  四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）用法：

  稱取本品93.55g，溶解于1050mL蒸餾水中，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15分鐘，臨用前加入20%碘液 20mL，0.1% 煌綠10mL，現配現用，不宜久置。培養結果如圖1所示：

圖1 弗氏檸檬酸桿菌在TTB中的培養結果

  3.2 分離培養

  輕輕混勻增菌液，每份增菌液用接種環接種沙門氏菌志賀氏菌分離瓊脂（SS）平板、亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板。采用三區法或四區法劃線，以獲得單個菌落。將平板倒置于36℃±1℃，SS瓊脂平板培養18h～24h，BS瓊脂平板培養40h～48h。

  從SS平板和BS平板上分別挑取3個~5個可疑菌落，在營養瓊脂斜面上純化培養。檸檬酸桿菌在SS瓊脂平板上的可疑菌落為圓形，粉紅色、黑色、無色菌落，或粉紅色、黑色中心菌落；在BS瓊脂平板上的可疑菌落為棕綠色或棕黑色菌落。

  SS瓊脂培養基檢驗原理：

  胨、牛肉浸粉提供碳源、氮源、維生素和礦物質；乳糖為可發酵的糖類；三號膽鹽、枸櫞酸鈉和煌綠抑制革蘭氏陽性菌及大多數的大腸菌群和變形桿菌；硫代硫酸鈉和枸櫞酸鐵用于檢測硫化氫的產生，使菌落中心呈黑色；中性紅為pH指示劑，發酵糖產酸的菌落呈紅色，不發酵糖的菌落為無色；瓊脂是培養基的凝固劑。

  SS瓊脂培養基用法：

  稱取本品63.53g，溶解于1000mL蒸餾水中，加熱煮至沸，不必高壓蒸汽滅菌，冷至45℃-50℃倒成平板。培養結果如圖2所示：

圖2 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864在SS瓊脂平板上的培養結果

  亞硫酸鉍瓊脂（BS）檢驗原理：

  蛋白胨、牛肉粉在培養基中作為基礎營養物質，為細菌生長提供所需的氮源、碳源、維生素及一些礦物質等元素；葡萄糖可作為細菌生長代謝所需的能量物質；磷酸鹽對培養環境pH值起到緩沖作用。煌綠和亞硫酸鈉能抑制大腸桿菌、變形桿菌和革蘭氏陽性菌的生長。傷寒沙門氏菌及其他沙門氏菌能利用葡萄糖，將亞硫酸鹽還原成硫化物并與鐵反應使得菌落呈黑色，此外還可把鉍離子還原成金屬鉍，使菌落呈現金屬光澤，從而使沙門氏菌得到分離。

  亞硫酸鉍瓊脂（BS）用法：

  稱取本品50.3g，加入1000 mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，冷至45℃-50℃，搖勻，傾入無菌平皿備用。無需高壓滅菌。保存于黑暗處，48小時內使用。培養結果如圖3所示：

圖3 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864在BS瓊脂平板上的培養結果

  3.3 分離鑒定

  3.3.1 方法選擇

  對挑選的菌體進行革蘭氏染色，氧化酶試驗初步生化鑒定。革蘭氏染色陰性，氧化酶試驗陰性按3.3.2進行初步生化試驗。革蘭氏染色結果如圖4A，氧化酶試驗結果如圖4B：

圖4 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864革蘭氏染色結果，弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864氧化酶實驗結果

  3.3.2 初步生化鑒定

  使用營養瓊脂平板或斜面上純化分離的新鮮培養物（培養時間不超過24h）進行動力試驗、ONPG試驗、檸檬酸鹽試驗、DNA酶試驗（或明膠液化試驗）和V-P試驗。動力試驗、ONPG試驗和檸檬酸鹽試驗陽性，DNA酶試驗（或明膠液化試驗）和V-P試驗陰性的菌落為檸檬酸桿菌屬細菌。再次用營養瓊脂純化培養18h～24h后，進行后續生化試驗。初步生化鑒定結果如圖5所示：

圖5 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864初步生化鑒定結果

  3.3.3 生化鑒定

  使用營養瓊脂上的新鮮培養物（培養時間不超過24 h）按表1各項生化試驗進行檸檬酸桿菌各種的鑒定。確證鑒定結果如圖6所示：

表1 檸檬酸桿菌屬生化鑒定表

圖6 弗氏檸檬酸桿菌確證生化鑒定結果

四、結果判定與結果報告

  4.1 結果判定

  4.1.1 檸檬酸桿菌屬

  革蘭氏染色陰性，氧化酶實驗陰性，生化反應符合3.3.2要求的菌落，判定為檸檬酸桿菌屬細菌。

  4.1.2 檸檬酸桿菌

  革蘭氏染色陰性，氧化酶實驗陰性，生化反應結果與3.3.2和3.3.3中表1的生化反應結果相符，或根據生化鑒定試劑盒、生化鑒定系統鑒定到檸檬酸桿菌屬的結果，可判定為特定的檸檬酸桿菌。

  4.2 結果報告

  生化鑒定結果符合檸檬酸桿菌生化特性，按增菌培養的陽性瓶數，應用MPN表，查出每100 g樣品中的MPN值。檢測結果報告為每100 g樣品中檸檬酸桿菌（屬或種）的MPN值。

表2 可能數（MPN）表（95%置信區間）

使用三管法，接種量分別為10.0 g，1.0 g和0.1 g。

注:本文屬海博生物原創,未經允許不得轉載。