根據(jù)《獸藥管理條例》和《獸藥注冊(cè)辦法》規(guī)定，我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素和總蛋白測(cè)定法，現(xiàn)予發(fā)布，自發(fā)布之日起執(zhí)行。
特此公告。
附件：1.口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測(cè)定法
2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
農(nóng)業(yè)部
2014年3月12日
附件1
口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測(cè)定法
吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中，置50±5℃水浴90分鐘，然后在4℃條件下，以15000 g離心10分鐘，取水相5.0 ml，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》一部附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。每頭份疫苗中內(nèi)毒素含量應(yīng)不高于50 EU。
附件2
口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫，在3個(gè)1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶后，按附注進(jìn)行檢驗(yàn)。每毫升疫苗總蛋白含量應(yīng)不高于500μg。
附注：口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
1.方法與原理
本法適用于口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測(cè)。本法系福林酚法(lowry法)，依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。
2.試劑與儀器
2.1試劑丙酮（分析純）、無(wú)菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒；
2.2設(shè)備酶標(biāo)儀（全波長(zhǎng)），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器，單通道和多通道移液器，渦旋震蕩儀，酶標(biāo)板振蕩器等。
3.操作步驟
3.1標(biāo)準(zhǔn)系列稀釋液制備將商品化試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀釋。
3.2檢驗(yàn)疫苗處理取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫?fù)u勻后，在3個(gè)1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000 g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶備用。
3.3反應(yīng)板加樣與讀數(shù)
3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液40μl，以及三重復(fù)待檢疫苗樣品40μl，分別加入到96孔板內(nèi)。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內(nèi)試劑，立即用振蕩器混勻30秒；
3.3.2封膜，室溫孵育10分鐘；
3.3.3各孔內(nèi)分別加入20μl 1倍酚試劑（試劑盒內(nèi)為2倍，用前用去離子水現(xiàn)稀釋?zhuān)⒓从谜袷幤骰靹?0秒；
3.3.4封膜，室溫孵育30分鐘；
3.3.5酶標(biāo)儀測(cè)定750nm吸光值，保存讀數(shù)。
3.4數(shù)據(jù)處理
根據(jù)系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液的濃度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值為X軸，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，依據(jù)趨勢(shì)線(xiàn)求得多項(xiàng)式，其多項(xiàng)式R2≥0.98。
將被檢樣品的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)蛋白獲得的多項(xiàng)式，計(jì)算樣品中蛋白含量，根據(jù)取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1，免疫劑量為2ml時(shí)，100μl疫苗經(jīng)丙酮沉淀后用50μl去離子水復(fù)溶，測(cè)得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度，或2ml疫苗中蛋白濃度。結(jié)果判定時(shí)，將測(cè)定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。
3.5結(jié)果判定
若測(cè)定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500μg，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測(cè)定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500μg，判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。
3.6檢測(cè)數(shù)據(jù)處理舉例
3.6.1收集數(shù)據(jù)如表所示
上述表格中，A1-A9為系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白濃度依次增高；B、C、D行中1-6列為檢測(cè)樣品750nm吸光值，B1-B6為6批不同批次疫苗樣品，每一列為同一疫苗樣品三個(gè)重復(fù)。
3.6.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：將上表中數(shù)據(jù)復(fù)制到EXCELL表格中，
采用EXCEL程序，選中1-9列對(duì)應(yīng)的兩行數(shù)據(jù)→“插入”→“散點(diǎn)圖”，選擇“帶平滑線(xiàn)和數(shù)據(jù)標(biāo)記的散點(diǎn)圖”，得到以750nm吸光值為X軸，以蛋白濃度為Y軸的曲線(xiàn)圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢(shì)線(xiàn)”→“其他趨勢(shì)線(xiàn)選項(xiàng)”，選中“多項(xiàng)式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可信。每一塊96孔板應(yīng)設(shè)一組標(biāo)準(zhǔn)并繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
3.6.3數(shù)值計(jì)算
以樣品測(cè)定OD750值為X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y為蛋白濃度，以表中第一批疫苗測(cè)定結(jié)果為例。該疫苗三重復(fù)測(cè)定的OD750數(shù)據(jù)（X）分別為：0.677、0.640、0.641，代入公式計(jì)算蛋白含量（Y）分別為：334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml，該數(shù)據(jù)為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計(jì)算三重復(fù)數(shù)值的平均值（AVERAGE）為316μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)差（STDEV.P）為13.1，變異系數(shù)為4.15%（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值*100%），將每毫升水相抗原中總蛋白含量，除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量，該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法，可計(jì)算其他樣品的總蛋白含量。
3.6.4結(jié)果判定
同一樣品不同重復(fù)間變異系數(shù)應(yīng)小于5.3%，否則試驗(yàn)不成立，應(yīng)重做。若測(cè)定值小于或等于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測(cè)定值大于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。
特此公告。
附件：1.口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測(cè)定法
2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
農(nóng)業(yè)部
2014年3月12日
附件1
口蹄疫滅活疫苗內(nèi)毒素測(cè)定法
吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中，置50±5℃水浴90分鐘，然后在4℃條件下，以15000 g離心10分鐘，取水相5.0 ml，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》一部附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。每頭份疫苗中內(nèi)毒素含量應(yīng)不高于50 EU。
附件2
口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫，在3個(gè)1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶后，按附注進(jìn)行檢驗(yàn)。每毫升疫苗總蛋白含量應(yīng)不高于500μg。
附注：口蹄疫滅活疫苗總蛋白測(cè)定法
1.方法與原理
本法適用于口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測(cè)。本法系福林酚法(lowry法)，依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。
2.試劑與儀器
2.1試劑丙酮（分析純）、無(wú)菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒；
2.2設(shè)備酶標(biāo)儀（全波長(zhǎng)），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器，單通道和多通道移液器，渦旋震蕩儀，酶標(biāo)板振蕩器等。
3.操作步驟
3.1標(biāo)準(zhǔn)系列稀釋液制備將商品化試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀釋。
| 編號(hào) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 母液（μl） | 0 | 5 | 25 | 50 | 100 | 150 | 200 | 300 | 400 |
| 去離子水（μl） | 400 | 395 | 375 | 350 | 300 | 250 | 200 | 100 | 0 |
| 終濃度（μg/ml） | 0 | 25 | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 | 1500 | 2000 |
3.2檢驗(yàn)疫苗處理取1瓶疫苗恢復(fù)至室溫?fù)u勻后，在3個(gè)1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000 g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復(fù)溶備用。
3.3反應(yīng)板加樣與讀數(shù)
3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液40μl，以及三重復(fù)待檢疫苗樣品40μl，分別加入到96孔板內(nèi)。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內(nèi)試劑，立即用振蕩器混勻30秒；
3.3.2封膜，室溫孵育10分鐘；
3.3.3各孔內(nèi)分別加入20μl 1倍酚試劑（試劑盒內(nèi)為2倍，用前用去離子水現(xiàn)稀釋?zhuān)⒓从谜袷幤骰靹?0秒；
3.3.4封膜，室溫孵育30分鐘；
3.3.5酶標(biāo)儀測(cè)定750nm吸光值，保存讀數(shù)。
3.4數(shù)據(jù)處理
根據(jù)系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液的濃度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值為X軸，以蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，依據(jù)趨勢(shì)線(xiàn)求得多項(xiàng)式，其多項(xiàng)式R2≥0.98。
將被檢樣品的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)蛋白獲得的多項(xiàng)式，計(jì)算樣品中蛋白含量，根據(jù)取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1，免疫劑量為2ml時(shí)，100μl疫苗經(jīng)丙酮沉淀后用50μl去離子水復(fù)溶，測(cè)得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度，或2ml疫苗中蛋白濃度。結(jié)果判定時(shí)，將測(cè)定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。
3.5結(jié)果判定
若測(cè)定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500μg，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測(cè)定結(jié)果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500μg，判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。
3.6檢測(cè)數(shù)據(jù)處理舉例
3.6.1收集數(shù)據(jù)如表所示
| Value | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 0.102 | 0.149 | 0.336 | 0.504 | 0.836 | 1.122 | 1.334 | 1.702 | 1.923 | -- | -- | -- |
| B | 0.677 | 1.722 | 0.252 | 1.116 | 2.167 | 1.020 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| C | 0.640 | 1.704 | 0.230 | 1.050 | 2.195 | 0.962 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| D | 0.641 | 1.716 | 0.225 | 1.061 | 2.175 | 1.012 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| E | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| F | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| G | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
| H | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
上述表格中，A1-A9為系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白濃度依次增高；B、C、D行中1-6列為檢測(cè)樣品750nm吸光值，B1-B6為6批不同批次疫苗樣品，每一列為同一疫苗樣品三個(gè)重復(fù)。
3.6.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：將上表中數(shù)據(jù)復(fù)制到EXCELL表格中，
| Value | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| OD750 | 0.102 | 0.149 | 0.336 | 0.504 | 0.836 | 1.122 | 1.334 | 1.702 | 1.923 |
| 蛋白濃度μg/ml | 0 | 25 | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 | 1500 | 2000 |
采用EXCEL程序，選中1-9列對(duì)應(yīng)的兩行數(shù)據(jù)→“插入”→“散點(diǎn)圖”，選擇“帶平滑線(xiàn)和數(shù)據(jù)標(biāo)記的散點(diǎn)圖”，得到以750nm吸光值為X軸，以蛋白濃度為Y軸的曲線(xiàn)圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢(shì)線(xiàn)”→“其他趨勢(shì)線(xiàn)選項(xiàng)”，選中“多項(xiàng)式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可信。每一塊96孔板應(yīng)設(shè)一組標(biāo)準(zhǔn)并繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
3.6.3數(shù)值計(jì)算
以樣品測(cè)定OD750值為X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y為蛋白濃度，以表中第一批疫苗測(cè)定結(jié)果為例。該疫苗三重復(fù)測(cè)定的OD750數(shù)據(jù)（X）分別為：0.677、0.640、0.641，代入公式計(jì)算蛋白含量（Y）分別為：334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml，該數(shù)據(jù)為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計(jì)算三重復(fù)數(shù)值的平均值（AVERAGE）為316μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)差（STDEV.P）為13.1，變異系數(shù)為4.15%（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值*100%），將每毫升水相抗原中總蛋白含量，除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量，該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法，可計(jì)算其他樣品的總蛋白含量。
3.6.4結(jié)果判定
同一樣品不同重復(fù)間變異系數(shù)應(yīng)小于5.3%，否則試驗(yàn)不成立，應(yīng)重做。若測(cè)定值小于或等于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測(cè)定值大于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。
