spCas9 SpRY突變體體外酶切試劑盒

 產品簡介： 

     本產品主要用于spCas9 SpRY突變體體外酶切實驗和靶點篩選等實驗。SpCas9突變體SpRY識別的PAM序列為NRN（R為A/G）以及部分NYN（Y為C/T），與型spCas9的PAM序列NGG相比，極大的解除了PAM的限制，可供選擇的靶點更多。 
    
    本試劑盒可以在體外切割PCR產物、質粒等雙鏈DNA。試劑盒中提供了SpCas9突變體SpRY蛋白，反應緩沖液，以及對照sgRNA和底物DNA。使用該試劑盒可以快速開展體外酶切實驗和篩選適合該突變體的靶點。

 

   

產品規格：

活性定義：37℃，30分鐘切割1μg 1kB DNA雙鏈定義為1個活性單位。 
儲存條件：-20℃凍存

 

實驗步驟： 
1、切割反應： 
1.1需準備：底物DNA，濃度大于100ng/ul；sgRNA，濃度大于200ng/ul。 
！務必采用無RNA酶的耗材進行實驗，注意防止RNA酶污染。 
按照下表配制SpRY體外切割反應緩沖液，請按表中順序加入：

SpRY蛋白	5 μl
sgRNA	1μg（aμl）
底物DNA	1~2μg（bμl）
10×Cas9 Buffer	Xμl*
*X=0.1×(5+a+b)

 

 

 陽性對照反應：

SpRY蛋白	5μl
陽性對照sgRNA	5μl
陽性對照DNA	10μl
10×Cas9 Buffer	2 μl

1.2吹吸混合均勻。

反應程序： 
37℃ 30min
85℃ 10min

 

2、產物檢測： 
快速檢測：

在反應體系中加入5μlCleaner，混勻。55℃孵育5min。（本步驟及以后的步驟不必使用無RNA酶耗材操作） 取5μl進行凝膠電泳檢測（不必加入DNALoadingBuffer）。

 

乙醇沉淀法檢測： 
本方案耗時約30min，電泳條帶更清晰。 
本步驟及以后的步驟不必使用無RNA酶耗材操作

加水將反應產物補足50μl。 加入50μl酚氯仿異戊醇試劑。震蕩混勻。 室溫12000rpm離心5min。 取上清至新的1.5ml離心管，加入5 μl 3M NaAc pH5.2，混勻。 加入110μl無水乙醇，混勻。 4℃ 12000rpm離心10min。 去除上清，加入500μl 70%乙醇，震蕩混勻。 4℃ 12000rpm離心5min。 去除上清，空離心2min，12000rpm，用移液器盡量吸去殘留液體，開口室溫放置2-5min。 加入10-15μl蒸餾水，震蕩溶解沉淀。

取3-5μl進行凝膠電泳檢測。 
2、陽性對照電泳結果： 
陽性對照DNA為760bp 雙鏈DNA。含有單一靶點。切割產物為兩條帶分別是505bp左右和255bp左右。 
 
M：DL2000 DNA marker
1：SpRY蛋白不加gRNA切割30min
2：SpRY蛋白加gRNA1切割30min
3：SpRY蛋白加gRNA2切割30min
4：SpRY蛋白加gRNA3切割30min

 

產品保存和使用注意事項：

SpRY蛋白使用過程中盡量保持低溫。 陽性對照sgRNA需用無RNA酶槍頭取用，以免RNase污染導致降解。 若切割效果不理想，可提高sgRNA的含量。

相關產品： 
sgRNA體外轉錄試劑盒貨號：PC1380
Cas9體外酶切試劑盒貨號：PC1400

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