中國農(nóng)大新聞網(wǎng)訊 家畜干細(xì)胞在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、細(xì)胞培養(yǎng)人造肉生產(chǎn)和優(yōu)良品種培育等方面具有巨大應(yīng)用前景。自1981年小鼠胚胎干細(xì)胞 （mESCs）獲得成功以來，國內(nèi)外科學(xué)家一直試圖建立穩(wěn)定的、可長期傳代的大家畜胚胎多能干細(xì)胞系，但始終未獲得成功。近日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院韓建永教授團隊聯(lián)合國內(nèi)多家單位獲得重大突破，成功建立了目前世界家畜干細(xì)胞傳代次數(shù)最多（傳代260次以上）、可進行多次基因編輯操作的豬胚胎干細(xì)胞系，攻克了豬胚胎上胚層多能干細(xì)胞建系的國際難題。11月30日，該研究成果在線發(fā)表在國際著名學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞研究》（Cell Research）上。
豬既是重要的家畜，也是重要的實驗動物，在基礎(chǔ)研究、人類疾病模型、異種器官移植等領(lǐng)域用途廣泛。針對家畜胚胎上胚層多能干細(xì)胞建系困難，傳代次數(shù)短，難以承受多次基因編輯操作等國際難題， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)韓建永團隊聯(lián)合四川農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)院動物研究所、中國科學(xué)院北京基因研究所、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位，以豬為模式生物，開展了聯(lián)合科技攻關(guān)，取得家畜胚胎干細(xì)胞領(lǐng)域的重大突破。
研究人員從早期胚胎多能性發(fā)育調(diào)控分子機制入手，攻克豬早期胚胎單細(xì)胞分離技術(shù)， 首次繪制了豬胚胎第0-14天（完整的附植前階段）高質(zhì)量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜， 解析了豬上胚層多能性狀態(tài) （初始態(tài)、中間態(tài)和激發(fā)態(tài)） 變化及調(diào)控的分子機制；基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)， 創(chuàng)制了豬原腸化前上胚層多能干細(xì)胞 （pgEpiSCs） 培養(yǎng)體系， 成功建立15株細(xì)胞系， 細(xì)胞維持上胚層多能性狀態(tài)， 具有典型干細(xì)胞特征， 最長傳代次數(shù)超過260代，是目前世界上已報道傳代次數(shù)最多的大動物干細(xì)胞系；對pgEpiSCs進行了Hi-C, ChIP-seq, ATAC-seq等多組學(xué)聯(lián)合分析，從三維基因組層面發(fā)現(xiàn)pgEpiSCs具有較強的組織分化能力， 鑒定了75個在pgEpiSCs中具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子， 為后續(xù)豬多能干細(xì)胞調(diào)控機制研究奠定了重要基礎(chǔ)；通過對pgEpiSCs進行3次不同方式基因編輯，包括隨機插入、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的定點插入以及單堿基編輯器介導(dǎo)的堿基C到T置換， 并以經(jīng)過三次基因編輯的干細(xì)胞系為供體細(xì)胞， 通過核移植技術(shù)，獲得來源于pgEpiSCs、出生存活的基因編輯克隆豬，解決了家畜干細(xì)胞難以承受長周期、多次基因編輯的國際難題。
該成果具有廣闊的應(yīng)用前景：
一是在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，作為一種全新的、穩(wěn)定的豬胚胎多能干細(xì)胞系，pgEpiSCs成功建系開創(chuàng)了家畜多能干細(xì)胞研究的新方向。與小鼠相比，豬的胚胎發(fā)育和人類更加相似， 豬的胚胎干細(xì)胞是研究人類胚胎發(fā)育更為理想的細(xì)胞模型。通過豬、人、小鼠等不同物種的多能干細(xì)胞比較，能夠發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞多能性維持的物種間差異性和統(tǒng)一性， 為異種器官移植等再生醫(yī)學(xué)研究提供理論依據(jù)。
二是在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，pgEpiSCs可作為未來細(xì)胞培養(yǎng)等基于細(xì)胞的功能性產(chǎn)品的種子細(xì)胞。目前細(xì)胞培養(yǎng)肉研制的種子細(xì)胞多為肌肉和脂肪細(xì)胞的祖細(xì)胞， 并不具有長期傳代增殖能力，成為體外大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)肉的技術(shù)瓶頸。pgEpiSCs能夠在體外長期穩(wěn)定傳代， 通過體外大規(guī)模培養(yǎng)， 獲得大量初始細(xì)胞， 再通過定向誘導(dǎo)分化獲得肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，可以解決“種子細(xì)胞”傳代時間短等細(xì)胞培養(yǎng)肉的技術(shù)難題。
三是在醫(yī)學(xué)模式動物研究領(lǐng)域，pgEpiSCs與基因編輯結(jié)合， 可用于構(gòu)建人類疾病模型或抗病豬模型。傳統(tǒng)的基于體細(xì)胞基因編輯和克隆的技術(shù)囿于體細(xì)胞難以耐受多次基因編輯， 難以同時獲得多基因編輯克隆家畜， 通常需要采用重復(fù)性克隆（re-cloning）和重新分離成纖維細(xì)胞， 達(dá)到多基因編輯的目的，周期短，效率低。實驗證實豬上胚層多能干細(xì)胞對基因編輯有很好的耐受性，至少可以耐受三次連續(xù)的基因編輯， 這將大大縮短獲得多基因編輯克隆豬的時間和成本。
四是在家畜優(yōu)良品種培育領(lǐng)域，pgEpiSCs通過定向誘導(dǎo)分化為精子和卵母細(xì)胞可以實現(xiàn)干細(xì)胞育種。胚胎干細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)完成配子發(fā)育的整個過程， 形成有功能的精子或卵母細(xì)胞。將干細(xì)胞與基因組測序和基因組選擇等技術(shù)結(jié)合， 再通過體外生殖細(xì)胞誘導(dǎo)和體外受精， 獲得子代胚胎， 結(jié)合基因組選擇技術(shù)，可以在實驗室中完成優(yōu)良家畜胚胎的批量生產(chǎn)和精準(zhǔn)選擇，實現(xiàn)家畜干細(xì)胞育種，可顯著縮短世代間隔和提高選擇強度， 快速獲得30~40倍的遺傳增益，實現(xiàn)重要經(jīng)濟性狀的快速遺傳改良。
該研究受到國家重點研發(fā)計劃（2016YFA0100202）、高層次人才計劃等項目資助， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院博士生郅明雷、張金穎， 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)唐茜子教授， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院高帥副教授， 中國科學(xué)院動物研究所余大為博士為本文共同第一作者， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院韓建永教授， 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李明洲教授， 中國科學(xué)院北京基因組研究所鄭彩宏博士， 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授為本文的共同通訊作者。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏紅江教授和中國科學(xué)院動物研究所周琪研究員為資深作者。
全文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00592-9
供稿：生物學(xué)院
日期：2021-12-06
豬既是重要的家畜，也是重要的實驗動物，在基礎(chǔ)研究、人類疾病模型、異種器官移植等領(lǐng)域用途廣泛。針對家畜胚胎上胚層多能干細(xì)胞建系困難，傳代次數(shù)短，難以承受多次基因編輯操作等國際難題， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)韓建永團隊聯(lián)合四川農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)院動物研究所、中國科學(xué)院北京基因研究所、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位，以豬為模式生物，開展了聯(lián)合科技攻關(guān)，取得家畜胚胎干細(xì)胞領(lǐng)域的重大突破。
研究人員從早期胚胎多能性發(fā)育調(diào)控分子機制入手，攻克豬早期胚胎單細(xì)胞分離技術(shù)， 首次繪制了豬胚胎第0-14天（完整的附植前階段）高質(zhì)量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜， 解析了豬上胚層多能性狀態(tài) （初始態(tài)、中間態(tài)和激發(fā)態(tài)） 變化及調(diào)控的分子機制；基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)， 創(chuàng)制了豬原腸化前上胚層多能干細(xì)胞 （pgEpiSCs） 培養(yǎng)體系， 成功建立15株細(xì)胞系， 細(xì)胞維持上胚層多能性狀態(tài)， 具有典型干細(xì)胞特征， 最長傳代次數(shù)超過260代，是目前世界上已報道傳代次數(shù)最多的大動物干細(xì)胞系；對pgEpiSCs進行了Hi-C, ChIP-seq, ATAC-seq等多組學(xué)聯(lián)合分析，從三維基因組層面發(fā)現(xiàn)pgEpiSCs具有較強的組織分化能力， 鑒定了75個在pgEpiSCs中具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子， 為后續(xù)豬多能干細(xì)胞調(diào)控機制研究奠定了重要基礎(chǔ)；通過對pgEpiSCs進行3次不同方式基因編輯，包括隨機插入、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的定點插入以及單堿基編輯器介導(dǎo)的堿基C到T置換， 并以經(jīng)過三次基因編輯的干細(xì)胞系為供體細(xì)胞， 通過核移植技術(shù)，獲得來源于pgEpiSCs、出生存活的基因編輯克隆豬，解決了家畜干細(xì)胞難以承受長周期、多次基因編輯的國際難題。
該成果具有廣闊的應(yīng)用前景：
一是在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，作為一種全新的、穩(wěn)定的豬胚胎多能干細(xì)胞系，pgEpiSCs成功建系開創(chuàng)了家畜多能干細(xì)胞研究的新方向。與小鼠相比，豬的胚胎發(fā)育和人類更加相似， 豬的胚胎干細(xì)胞是研究人類胚胎發(fā)育更為理想的細(xì)胞模型。通過豬、人、小鼠等不同物種的多能干細(xì)胞比較，能夠發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞多能性維持的物種間差異性和統(tǒng)一性， 為異種器官移植等再生醫(yī)學(xué)研究提供理論依據(jù)。
二是在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，pgEpiSCs可作為未來細(xì)胞培養(yǎng)等基于細(xì)胞的功能性產(chǎn)品的種子細(xì)胞。目前細(xì)胞培養(yǎng)肉研制的種子細(xì)胞多為肌肉和脂肪細(xì)胞的祖細(xì)胞， 并不具有長期傳代增殖能力，成為體外大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)肉的技術(shù)瓶頸。pgEpiSCs能夠在體外長期穩(wěn)定傳代， 通過體外大規(guī)模培養(yǎng)， 獲得大量初始細(xì)胞， 再通過定向誘導(dǎo)分化獲得肌肉細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，可以解決“種子細(xì)胞”傳代時間短等細(xì)胞培養(yǎng)肉的技術(shù)難題。
三是在醫(yī)學(xué)模式動物研究領(lǐng)域，pgEpiSCs與基因編輯結(jié)合， 可用于構(gòu)建人類疾病模型或抗病豬模型。傳統(tǒng)的基于體細(xì)胞基因編輯和克隆的技術(shù)囿于體細(xì)胞難以耐受多次基因編輯， 難以同時獲得多基因編輯克隆家畜， 通常需要采用重復(fù)性克隆（re-cloning）和重新分離成纖維細(xì)胞， 達(dá)到多基因編輯的目的，周期短，效率低。實驗證實豬上胚層多能干細(xì)胞對基因編輯有很好的耐受性，至少可以耐受三次連續(xù)的基因編輯， 這將大大縮短獲得多基因編輯克隆豬的時間和成本。
四是在家畜優(yōu)良品種培育領(lǐng)域，pgEpiSCs通過定向誘導(dǎo)分化為精子和卵母細(xì)胞可以實現(xiàn)干細(xì)胞育種。胚胎干細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)完成配子發(fā)育的整個過程， 形成有功能的精子或卵母細(xì)胞。將干細(xì)胞與基因組測序和基因組選擇等技術(shù)結(jié)合， 再通過體外生殖細(xì)胞誘導(dǎo)和體外受精， 獲得子代胚胎， 結(jié)合基因組選擇技術(shù)，可以在實驗室中完成優(yōu)良家畜胚胎的批量生產(chǎn)和精準(zhǔn)選擇，實現(xiàn)家畜干細(xì)胞育種，可顯著縮短世代間隔和提高選擇強度， 快速獲得30~40倍的遺傳增益，實現(xiàn)重要經(jīng)濟性狀的快速遺傳改良。
該研究受到國家重點研發(fā)計劃（2016YFA0100202）、高層次人才計劃等項目資助， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院博士生郅明雷、張金穎， 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)唐茜子教授， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院高帥副教授， 中國科學(xué)院動物研究所余大為博士為本文共同第一作者， 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院韓建永教授， 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李明洲教授， 中國科學(xué)院北京基因組研究所鄭彩宏博士， 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授為本文的共同通訊作者。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏紅江教授和中國科學(xué)院動物研究所周琪研究員為資深作者。
全文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00592-9
供稿：生物學(xué)院
日期：2021-12-06
